Caracterización bioquímica y funcional de una β-glicosidasa hipertermofílica Pubblico Deposited
Se caracterizó bioquímica y funcionalmente una p-glicosidasa hipertermofílica capaz de hidrolizar la lactosa y se probó su utilidad en leche. La actividad específica de la (3- glicosidasa fue de 1,965.33 UE/mg de proteína; una Unidad Enzimática (UE) de pglicosidasa se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de glucosa por minuto a 9OOC, pH 6.6. Los parámetros cinéticos KM y V,,, usando a la lactosa como sustrato a 9OOC, fueron 234.41mM y 102.77pmol/mL.min, respectivamente. El pH óptimo fue 4.5. La energía de activación fue de 7,698.34 cal/mol. No se encontró influencia en la actividad enzimática por la incorporación de diferentes concentraciones de grupos sulfhidrilo como p-mercaptoetanol y cisteina (0-500pM de grupos sulfhidrilo). La actividad enzimática fue inhibida por los cationes Ca2+ y Na', sin encontrar ninguna influencia'en la adición de los iones K+ y Mg2+ (5mM) y activada significativamente por Mn2+ (5mM). Se encontró que con galactosa 5, 10 y 15 mM, y con glucosa 10 y 15mM, la enzima se inhibe significativamente. La enzima formó oligosacáridos a medida que transcurrió el tiempo de reacción, mismos que empezaron a desaparecer al minuto 270 y que desaparecieron por completo al minuto 360. Se determinó el peso molecular de las tres subunidades que mostraron actividad de p-galactosidasa a 37 y 7OoC (212,763 Da, 175,752 Da y 102,020 Da). Se encontró que la (3-glicosidasa de estudio es pura, mientras que la p-galactosidasa de E coli utilizada como referencia no es pura, esto mediante la determinación de actividad en geles de electroforésis no desnaturalizante a 37 y 70 "C. Se comprobó una gran termorresistencia de la enzima ya que conserva su actividad después de someter a la enzima a tratamientos térmicos similares a la pasteurización y ultrapasteurización utilizando un calorimetro diferencial de barrido. Finalmente se comprobó la actividad enzimática de la p-glicosidasa en leche donde se encontró una mayor hidrólisis en ésta que en solución amortiguadora de fosfatos con lactosa al 5%. De acuerdo a los resultados obtenidos es factible utilizar la p-glicosidasa de estudio para la hidrólisis de la lactosa en leche adicionándole antes del tratmiento térmico ya que la enzima conserva su actividad después de éste, pudiéndose efectuar la hidrólisis en el empaque.
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