Efecto del cadmio en la acumulación de lípidos a nivel hepático en un modelo murino Public Deposited
Cadmium (Cd) is a toxic metal that is found in the earth's crust, without a biological function, with characteristics similar to those of essential elements for the human body, such as calcium (Ca) and zinc (Zn). This metal is obtained from natural sources such as volcanic emissions or subproducts of elements obtained such as Zn and lead (Pb), among others, as well as anthropogenic sources such as the manufacture of nickelcadmium batteries because it is a good conductive metal y. Its anti-corrosive characteristics. Currently, humans are exposed to Cd primarily to environmental pollution, just like its presence in the food chain for the contaminated water that is used for the irrigation of plants; it has been seen that phosphate fertilizers contain Cd and that some vegetables are capable of storing, these include vegetables leaves as chard and lettuce, as well as some seeds like rice. Once Cd is ingested, it is absorbed at the intestinal level and distributed in the blood, such as the Cd-albumin complex, which is deposited mainly in the liver. Several studies in vitro in cell lines or primary hepatocyte culture obtained from mice have found that Cd is capable of inducing expression of a small protein of 6 kDa named metallothionein (MT-II) such as protection mechanism and Cd is involved in programmed cell death (apoptosis), in addition, have found in this models that Cd is capable of inducing steatosis to promote the lipid accumulation in the hepatocytes for diverse mechanism among them, affecting of autophagy flux and therefore stopped the lipid degradation, just as promote the lipid synthesis to induces the content increment of lipogenic enzymes. That is why the interest of this project was evaluated if the Cd promotes hepatic lipid accumulation and elucidates the molecular mechanisms capable of triggering at a hepatic level in a murine model. It worked with mice of 8 weeks of CD-1 strain exposed to Cd for one month (sub-chronic) and three months (chronic). For the one-month group, the measurement of water volume and food consumption was carried out, and in the case of the three-month group with the one-month group, the follow-up of body weight was carried out. After any time, one night before euthanasia, the animals are placed in metabolic cages for the urine to be obtained. In this urine, the albumin presence was evaluated through probes that included electrophoresis and Coomassie Blue stain. In addition, the total protein content in urine with BCA was determined. The animals were euthanized and obtained serum for the determination of hepatic functionality with the Kenshin-2 strips and photos at the systemic level; the liver was into a photo, and the obtained liver weight was to evaluate the quotient of liver weight with respect to the mouse weight. Later, one part of the liver was collected and put in PFA 4% and then was embedded in paraffin to realize histological sections of 8 µm and then hematoxylin and eosin (H&E) stain and make the morphometric analysis in both times, for the samples of three moths also made the determination of collagen in tissue for Red Sirius stain. To evaluate the content of Cd and element how Cd and other elements such as manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), copper (Cu), zinc (Zn), selenium (Se), and iodine (I) in a chronic exposure was employed the Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) technique. Also, it was determined in liver samples of sub-chronic and chronic exposure the total cholesterol with O-phthalneyde (OPA) technique, as well as for the quantification of triglyceride content with the Triglyceride Assay Kit. Fresh tissue was embedded on Optimal Cutting Temperature (OCT) for histological sections and stained with Oil Red O (ORO) to evaluate the lipid droplet content observed in the clear field microscope. In addition, the lipid droplet content and cholesterol were determined using a BODIPY stain in the confocal microscope. The protein was obtained and quantified for the determination of the activation of signaling pathways AKT/mTOR and MAPKs family (ERK, p38, and JNK) and the expression of proteins involved in the lipid and cholesterol synthesis such as SREBP-1c, ACLY, FasN and HMCoA, antioxidants enzymes such as SOD-1, GPx-1, Catalase, GPx-1/2 and GPx-4, HSP-70 protein and transcription factor STAT3 as well as to evaluate the MT-II expression by Western Blot. In obtained samples of sub-chronic exposure, the level of lipoperoxidation was quantified by the Thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) technique. It was demonstrated that Cd did not affect the food and water consumption of animals, nor affect body weight or quotient of liver weight with respect to body weight; at the macroscopic level, the mice of one month showed an intestinal inflammation; however, at three months the inflammation it was not persistent and in hepatic level, did not show morphological alterations in a sub-chronic and chronic exposure. The Cd consumption for three months promotes its deposit in the liver without altering the content of elements: Mn, Fe, Co, Cu, Zn y Se; Cd consumed for around three months only the 0.095% was quantified in the liver, a percentage that is capable of alter the I level, to found and strong positive correlation between Cad and I. In addition, it was found that Cd promotes hepatocyte proliferation in sub-chronic exposure, in contrast to chronic consumption, which promotes hepatocyte cell death apart from proliferation. The functionality of hepatic enzymes did not alter with the sub-chronic and chronic consumption, and only triglycerides content at one month decrease in serum. Cd exposure for around one and three months apparently did not alter the renal functionality not to show proteinuria increment. Regarding collagen deposition, the Cd exposure at three months did not promote collagen accumulation in hepatic tissue. In addition, it found that Cd did not promote MT-II increment content in liver, probably, to did not alter Zn content. Cd did not alter the liver's REDOX state to prevent lipoperoxidation increment and, apparently, maintain antioxidant enzymes at a stable level. At these exposure times, it was found that Cd did not promote the cholesterol and triglycerides hepatic accumulation to not activate the lipogenic route AKT/mTOR, or it targeted SREBP-1c and did not promote the expression of target genes lipogenicsuch as ACLY and FasN. It also found that Cd did not favor the activation of transcription factor STAT-3, so the HSP-70 accumulation was not promoted. It was determined that Cd promotes the p38 activation at three months of exposure, maybe like a possible inductor of death cells. Moreover, it was found that Cd reduces the JNKactivation without altering ERK. However, the role of p38 and JNK in chronic consumption of Cd remains to be elucidated. In addition to this, it found that Cd promotes the increment of I in the liver; however, the participation of I in the exposure of this toxic metal is unknown. These results suggest that Cd is a hepatic damage inductor that promotes the hepatocyte's proliferation in a short time of consumption and in a long time, in addition to proliferation, promotes the hepatocyte's death cell. The one- and three-month exposure represents a short time for lipogenic machinery induction; therefore, it does not promote lipid increment in the liver.
El cadmio (Cd) es un metal tóxico que se encuentra en la corteza terrestre, sin función biológica con características químicas similares a elementos esenciales para el cuerpo humano como el calcio (Ca) y el zinc (Zn). Este metal se encuentra por fuentes naturales como las emisiones volcánicas o como subproducto de la obtención de elementos como el Zn y el plomo (Pb), entre otros, así como por fuentes antropogénicas como en la manufactura de pilas níquel-cadmio al ser un buen conductor y sus características anticorrosivas. En la actualidad, el humano se encuentra expuesto al Cd principalmente por la contaminación ambiental, así como por su presencia en la cadena alimenticia por el agua contaminada que se usa para riego de plantas, así mismo se ha encontrado en los fertilizantes fosfatados, y que algunos vegetales son capaces de almacenarlo, entre ellos se encuentran las hojas dehortalizas como las acelgas y la lechuga, así como algunas semillas como el arroz. Una vez que el Cd es ingerido, es absorbido a nivel intestinal y distribuido por el torrente sanguíneo unido a la albumina para ser depositado principalmente a nivel hepático. Diversos estudios in vitro en líneas celulares o en hepatocitos primarios obtenidos de ratón, han encontrado que el Cd es capaz de inducir la expresión de la proteína pequeña de 6 kDa llamada metalotioneina (MT-II) como mecanismo de protección y por otra parte, también está involucrado en desencadenar la muerte celular programada (apoptosis), así mismo, han encontrado en estos modelos experimentales que el Cd es capaz de inducir esteatosis al favorecer la acumulación de lípidos en los hepatocitos por diversos mecanismos entre ellos afectando el flujo de la autofagia y por lo tanto, frenar la degradación de lípidos, así como favoreciendo la síntesis de lípidos al incrementar el contenido de las enzimas lipogenicas. Es por lo que, el interés de este proyecto fue evaluar si el Cd favorece la acumulación de lípidos y dilucidar los mecanismos moleculares que es capaz de desencadenar a nivel hepático en un modelo murino. Se trabajó con ratones de 8 semanas de edad de la cepa CD-1, los cuales fueron expuestos a una concentración de 10 mg/L Cd por un mes (sub-crónico) y tres meses (crónico). Al grupo de un mes, se les midió el volumen de agua consumido, así como el consumo de alimento y en el caso del grupo de tres meses junto con el grupo de un mes, además se les llevó el seguimiento del peso de los ratones. Una vez transcurrido cada tiempo de exposición, una noche previa a la eutanasia los animales fueron puestos en cajas metabólicas para la obtención de orina. En esta orina se evaluó la presencia de albumina mediante pruebas que incluían electroforesis y tinción con Azul Coomassie. Además, se determinó el contenido total de proteínas utilizando la técnica de BCA. Posterior a la eutanasia de los ratones se obtuvo el suero para la determinación de funcionalidad hepática con las tiras reactivas Kenshin-2, así como fotos del sistema gastrointestinal y hepático, seguida de la recolección del hígado para la obtención del peso del órgano y determinar el cociente del peso del hígado con respecto al peso del ratón; posteriormente, del hígado se recolectó un remanente que fue colocado en PFA al 4% y en seguida fue embebido en parafina para realizar cortes histológicos de 8 µm y la posterior tinción con hematoxilina-Eosina (H&E) y realizar el análisis morfométrico en ambos tiempos. A las muestras de tres meses también se les evaluó la presencia de colágena con la tinción de Rojo Sirio. Para evaluar el contenido de Cd y de elementos como manganeso (Mn), hierro (Fe), cobalto (Co), cobre (Cu), zinc (Zn), yodo (I) y selenio (Se) a una exposición crónica se empleó la técnica de Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (por sus siglas en inglés ICP-MS). Además, se determinó en las muestras de hígado de exposición sub-crónica y crónica el colesterol total por la técnica O-phthaldehyde (OPA), así como el contenido de triglicéridos (TG) con el kit Triglyceryde Assay. Para evaluar el contenido de gotas lipídicas, muestras de tejido fresco fueron embebidas en OCT (Temperatura de corte óptima, por sus siglas en inglés) para realizar cortes histológicos y teñirlos con aceite rojo oleoso (ORO), observándolos en el microscopio de campo claro. También se determinó el contenido de gotas lípidos y de colesterol con la tinción BODIPY observándolos en el microscopio confocal. Se obtuvo y cuantificó proteína para la determinación de la activación de las rutas de señalización AKT/mTOR, así como la familia de las MAPKs (ERK, p38 y JNK) y, la expresión de proteínas involucradas en la síntesis de lípidos y colesterol como SREBP-1c, ACLY, FasN y HMCoAR, enzimas antioxidantes como SOD-1, GPx-1, Catalasa, GPx-1/2 y GPx-4, proteínas como HSP-70 y el factor de transcripción STAT3, así como la expresión de la MT-II por Western Blot. En muestras de exposición sub-crónica, se cuantificó el grado de lipoperoxidación por la técnica de TBARs (Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, por sus siglas en inglés). Se demostró que el Cd no afecta el consumo de alimento ni de agua de los animales, tampoco altera el peso corporal o el cociente peso del hígado con respecto al peso del ratón, a nivel macroscópico, los ratones de un mes mostraron inflamación intestinal, sin embargo, a los tres meses, esta inflamación no fue persistente y a nivel hepático no se observaron alteraciones morfológicas ni a una exposición sub-crónica o crónica. El consumo de Cd por tres meses favorece su depósito en el hígado sin alterar el contenido de elementos como Mn, Fe, Co, Cu, Zn y Se; del Cd consumido durante los tres meses solo el 0.095% se cuantificó en el órgano, porcentaje que fue capaz de alterar los niveles del I, al encontrar una correlación fuerte positiva entre el Cd y el I. Además, se encontró que el Cd favorece a un consumo sub-crónica, la proliferación de los hepatocitos, en contraste al consumo crónico, además de la proliferación, favorece la muerte de los hepatocitos. Las enzimas de funcionalidad hepática no se ven alteradas con el consumo sub-crónico y crónico y solo el contenido de TG a un mes de consumo disminuye en suero. La exposición a Cd durante uno y tres meses aparentemente no altera la funcionalidad renal, al no mostrar un incremento en la proteinuria. Con respecto a la deposición de colágena, la exposición a Cd durante tres meses no favorece que esta se acumule en el tejido hepático. Aunado a ello, se encontró que el Cd no favorece el incremento del contenido de la MT-II en el hígado, probablemente por no alterar el contenido del Zn. El Cd no altera el estado REDOX en el hígado al no incrementar la lipoperoxidación y aparentemente al mantener los niveles de las enzimas antioxidantes estables. A estos tiempos de exposición, se encontró que el Cd no promueve la acumulación de colesterol o de triglicéridos a nivel hepático al no activar a la ruta lipogenica por excelencia AKT/mTOR, ni a su factor de transcripción blanco SREBP-1c y que este a su vez no promueve la expresión de genes blanco lipogenicos como ACLY y FasN. También se encontró que el Cd no favorece la activación del factor de transcripción STAT3 y, por lo tanto, no promueve el incremento en la expresión de HSP-70. Se determinó que el Cd favorece la activación de p38 a tres meses de exposición, quizás como posible inductor de muerte celular, así mismo, se encontró que el Cd reduce la activación de JNK, sin alterar a ERK. Sin embargo, falta dilucidar el papel que toma p38 y JNK en un consumo crónico de Cd. Aunado a ello, se encontró que el Cd favorece el incremento del I en el hígado, sin embargo, se desconoce la participación que tiene el I ante la exposición a este metal tóxico. Estos resultados sugieren que el Cd es un inductor de daño hepático que favorece la proliferación de hepatocitos en un tiempo corto de consumo y a tiempos más largos, además de la proliferación, favorece la muerte celular. La exposición a uno y tres meses representan un tiempo corto para la inducción de la maquinaria lipogenica y, por lo tanto, no se favorece el incremento de lípidos en el hígado.
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