Efecto del medio de cultivo sobre la expresión de proteínas antimicrobianos y su actividad conjunta con las especies reactivas de oxígeno en Lactiplantibacillus paraplantarum Público Deposited
El empleo de proteínas y péptidos antimicrobianos se presenta como una alternativa prometedora a los antibióticos tradicionales, que enfrentan crecientes desafíos por la resistencia de los patógenos. En las últimas décadas, se ha documentado que las bacterias ácido lácticas (BAL) sintetizan compuestos proteicos con propiedades antimicrobianas, como bacteriocinas, peptidoglucano hidrolasas (PGHs) y, recientemente algunas proteínas ribosomales (RP). Los géneros de BAL conocidos por producir estos compuestos se encuentran Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus y Enterococcus. El origen de este proyecto se remonta al hallazgo en el grupo de investigación dirigido por la Dra. Edith Ponce Alquicira (UAM-Iztapalapa) de dos compuestos con actividad antimicrobiana contra microorganismos patógenos como Listeria innocua, Salmonella spp.y Escherichia coli, así mismo Weissella viridescens, un microrganismo catalogado como de deterioro de alimentos. Estos compuestos, con pesos moleculares de 13 y 66.2 kDa, fueron identificados como una proteína 50S ribosomal uL14 (RP uL14) y una proteína con actividad de muramidasa, respectivamente. Ambos producidos por Lacp. paraplantarum, aislada de un producto cárnico (salami). Además, se observó el efecto de la concentración de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo sobre su crecimiento y actividad antimicrobiana, siendo mayor en ambos casos al incrementar la concentración de nitrógeno en el medio de cultivo (CGB). En este trabajo, mediante la técnica de ionización por electrospray LC-MS/MS (OrbitrapTher), se identificó una proteína antimicrobiana de 66.2 kDa, previamente asociada con actividad de muramidasa, como N-acetilmuramidasa o MupG. Esta proteína pertenece al grupo de las peptidoglucano hidrolasa (PGHs) y es responsable de catalizar la hidrólisis del peptidoglucano (PG) ubicado en la pared celular bacteriana. Posteriormente, se realizó el análisis de expresión génica de las proteínas con actividad antimicrobiana en diversas concentraciones de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo, observando un efecto de la concentración de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo sobre su expresión. Se construyó el vector pTWIN1-bRPuL14, que incorpora la proteína ribosomal (RP uL14) en el vector pTWIN1. Esta construcción será esencial para futuras investigaciones, ya que permitirá expresar la proteína en su forma nativa, lo que facilita la realización de experimentos destinados a comprender su mecanismo de acción antimicrobiana aún no definido. Finalmente, el efecto antimicrobiano de RP uL14 podría atribuirse a su influencia en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales ocasiona daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), lípidos y proteínas del microorganismo objetivo, conduciendo a su muerte celular.
The use of antimicrobial proteins and peptides presents a promising alternative to traditional antibiotics, which face increasing challenges due to pathogen resistance. In recent decades, it has been documented that lactic acid bacteria (LAB) synthesize protein compounds with antimicrobial properties, such as bacteriocins, peptidoglycan hydrolases (PGHs), and recently some ribosomal proteins (RP). The LAB genera known to produce these compounds include Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, and Enterococcus. This project originated from the discovery by the research group led by PhD Edith Ponce Alquicira (UAM-Iztapalapa) of two compounds with antimicrobial activity against pathogenic microorganisms such as Listeria innocua, Salmonella spp., and Escherichia coli, as well as Weissella viridescens, a microorganism classified as a food spoilage agent. These compounds, with molecular weights of 13 and 66.2 kDa, were identified as a 50S ribosomal protein uL14 (RP uL14) and a protein with muramidase activity, respectively. Both were produced by Lacp. paraplantarum, isolated from a meat product (salami). Additionally, the effect of carbon and nitrogen concentration in the culture medium on its growth and antimicrobial activity was observed, with higher levels in both cases when the nitrogen concentration in the culture medium (CGB) was increased. In this work, using the electrospray ionization LC-MS/MS technique (OrbitrapTher), a 66.2 kDa antimicrobial protein, previously associated with muramidase activity, was identified as Nacetylmuramidase or MupG. This protein belongs to the peptidoglycan hydrolase (PGHs) group and is responsible for catalyzing the hydrolysis of peptidoglycan (PG) located in the bacterial cell wall. Subsequently, the gene expression analysis of proteins with antimicrobial activity was carried out at various carbon and nitrogen concentrations in the culture medium, observing an effect of the carbon and nitrogen concentration on their expression. The pTWIN1-bRPuL14 vector, incorporating the ribosomal protein (RP uL14) into the pTWIN1 vector, was constructed. This construct will be essential for future research, as it will allow the expression of the protein in its native form, facilitating experiments aimed at understanding its yet undefined antimicrobial mechanism of action. Finally, the antimicrobial effect of RP uL14 could be attributed to its influence on the generation of reactive oxygen species (ROS), which cause damage to the target microorganism's DNA, RNA, lipids, and proteins, leading to cell death.
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