En la presente investigación se caracterizó, desde un enfoque termodinámico, la asociación entre la variante estabilizada (L47C/G69C) de la cistatina C humana con la actinidina mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC), técnica de referencia para el estudio cuantitativo de interacciones biomoleculares. La ITC permite determinar con alta precisión la constante de unión (KU), la energía libre de unión (ΔGU), la entalpía de unión (ΔHU) y la entropía de unión (ΔSU), proporcionando información clave sobre el mecanismo de asociación molecular y la estabilidad del complejo formado. Para ello, se llevó a cabo el aislamiento y la purificación de la proteasa actinidina a partir del fruto del kiwi, bloqueando su cisteína catalítica con metilmetanotiosulfonato para prevenir su autohidrólisis. La cistatina C estabilizada (CCE) fue obtenida por expresión recombinante en Escherichia coli, seguida de purificación por cromatografía de intercambio catiónico. La verificación estructural de las proteínas se realizó mediante dicroísmo circular y espectrometría de masas. Se realizaron ensayos para constatar la actividad inhibitoria de la CCE sobre la actividad peptidasa de la papaína, utilizando el sustrato N-benzoil-arginina-p-nitroanilida (BApNA), tanto en ausencia como en presencia del inhibidor, obteniéndose para el último caso una inhibición aproximada del 90%. Para obtener los parámetros termodinámicos de la unión proteasa-inhibidor ambas proteínas se equilibraron en regulador de fosfatos 10 mM, pH 7.0 y 35.0 °C, ajustando la fuerza iónica a 0.10 M con NaCl. Los resultados indicaron que la cistatina C estabilizada se une a la actinidina, aún con su sitio catalítico bloqueado, mostrando una afinidad moderada con una KU promedio de 1.2 x 106 M-1 , HU de -23.6 kJ mol-1 y TSU de 9.4 kJ mol-1 , valores que se encuentran dentro del intervalo reportado para este tipo de complejos. Adicionalmente, se modeló la estructura del complejo CCEactinidina mediante un acoplamiento molecular rígido y se analizaron las interacciones en la interfaz molecular mediante simulaciones de dinámica molecular de 200 ns a 308.15 K, utilizando el software GROMACS 2023.1 y el campo de fuerzas AMBER. El complejo mostró una interfaz mayormente apolar compuesta por numerosos residuos hidrofóbicos, lo que concuerda con la contribución entrópica favorable. La interacción estuvo principalmente mediada por puentes de hidrógeno, puentes salinos e interacciones de van der Waals, reflejadas en un componente entálpico negativo que junto con la contribución entrópica positiva provocan un cambio favorable en la energía libre de unión. Tanto los resultados calorimétricos como los computacionales se compararon con los datos reportados por Tovar Anaya et al., 2019, para el complejo CCE−quimopapaina, mostrando este una afinidad mayor que el CCE−actinidina, con una constante de unión 10.3 veces más alta y una entalpía de unión 1.75 veces más negativa, lo que se ve reflejado en un mayor número de interacciones, una mayor área polar en su interfaz y una mayor estabilidad.
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