Caracterización de la inhibición de la infección in vitro por el VIH-1 mediada por glicosaminoglicanos de la leche humana - Ruiz Segura, Dante Uriel (Universidad Autónoma Metropolitana, 2018)
Methods. Two HIV-1 lymphotropic reference strains with X4 tropism: HIV-1IIIB and HIV-1MN, MT2 human lymphocyte cell line and CS from shark cartilage as a positive inhibition control of HIV infection in vitro were used. Inhibition assays were performed by preincubation of serial dilutions of human milk GAGs and CS (for comparison with non-human GAGs), with HIV-1IIIB and HIV-1MN supernatants before infecting the cells. After 5 days, HIV-1 p24 antigen and chemokines SDF-1 and MIP-1α, MIP-1β and RANTES were quantified by ELISA in culture supernatant. Significant inhibition of viral infectivity was defined as ≥80% reduction in p24 concentration with respect to the control. MT2 cells from the inhibition assays were analyzed by FACS for expression of CD4, CXCR4 and CCR5 receptors, as well as the immune activation marker: CD38 and the intracellular calcium (Ca2+) flux. Six groups of samples were tested in inhibition assays: MT2 controls, glycoconjugates controls (MT2 plus CS or GAGs), infection controls (infected MT2 with no glycoconjugates) and samples to test (infected MT2 plus CS or GAGs). Data were expressed as the mean ± the standard error of triplicate wells for each condition per experiment and are representative of 3 independent experiments. Results. Human milk GAGs significantly inhibited MT2 infection by HIV-1IIIB (91-100%) P immune activation status, the expression of HIV-1 receptors or chemokine production. Due to the potent inhibitory effect of human milk GAGs have shown in HIV-1 infection in vitro, they could be proposed as potential HIV-1 entry inhibitors and they may qualify as efficient microbicide agents for the virus.; Métodos. Se utilizaron dos cepas de referencia linfotrópicas del VIH-1 con tropismo X4: VIH-1IIIB y VIH-1MN, la línea celular de linfocitos humanos MT2 y CS de cartílago de tiburón como control positivo de inhibición de la infección in vitro por el VIH-1. Los ensayos de inhibición se realizaron al pre-incubar diluciones seriadas de GAGs y CS (para comparar con GAGs de origen no humano) con los sobrenadantes virales de VIH-1IIIB y VIH-1MN, antes de infectar a las células MT2. Después de 5 días se cuantificó en el sobrenadante de cultivo por ELISA, la concentración del antígeno P24 de la cápside del VIH-1 y de las quimiocinas SDF-1 y MIP-1α, MIP-1β y RANTES. Se consideró una inhibición significativa de la infección viral, cuando la reducción en la concentración de P24 fue ≥80% con respecto al control. En las células MT2 de los ensayos de inhibición, se realizó la medición cuantitativa por citometría de flujo de la expresión de los receptores CD4, CXCR4 y CCR5, así como del marcador de activación inmune CD38 y del flujo de calcio (Ca2+) intracelular. En los ensayos de inhibición se probaron 6 grupos de muestras: controles de células MT2, controles de los 2 glicoconjugados (MT2 con CS o GAGs), controles de infección (células MT2 infectadas sin glicoconjugado) y las muestras a evaluar (células MT2 infectadas con glicoconjugado). Los datos se expresaron como el promedio ± el error estándar de los triplicados de cada condición por experimento y son representativos de 3 experimentos independientes.; Introducción. La entrada del Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) a su célula blanco CD4+ es un proceso que involucra múltiples pasos. La interacción del VIH-1 con la célula ocurre principalmente por uniones no específicas a lectinas, proteoglicanos de heparán sulfato que son glicosaminoglicanos (GAGs) unidos a una cadena proteica, glicolípidos, o por interacciones entre ligando y receptor del virus con proteínas de la superficie celular. Se ha descrito que glicoconjugados sulfatados como glicolípidos y GAGs en la superficie de las células del colon, del epitelio vaginal y de la glía, se unen a la glicoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1, lo que sugiere que estos glicoconjugados pueden tener un papel importante en la entrada del virus a la célula y en la infección. Los GAGs son compuestos polisacáridos polianiónicos que se encuentran en prácticamente todas las membranas celulares y en algunos fluidos, como la leche humana. El condroitín sulfato (CS) y la mezcla de heparán sulfato/heparina son las especies que predominan en la leche humana. En estudios previos in vitro se demostró la capacidad que tienen los GAGs de la leche humana para inhibir la unión de gp120 con el receptor celular CD4 y que tienen un efecto inhibitorio potente en la infección de células CD4+ por cepas de referencia y aislados primarios del VIH-1. Se ha descrito también que la leche humana disminuye la expresión del receptor para quimiocinas y correceptor para el VIH-1: CCR5 en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), lo que podría sugerir además, que los GAGs presentes en la leche, podrían tener un efecto sobre las células CD4+, que contribuya a la inhibición de la infección del VIH-1, mediante la desregulación de la expresión de CCR5 y de esta forma prevenir la entrada del virus a la célula Objetivo. Caracterizar el efecto inhibidor de los GAGs de la leche humana en la infección in vitro del VIH-1 y evaluar su posible impacto sobre las células humanas CD4+.; Resultados. Los GAGs de la leche humana inhibieron de forma significativa la infección de las células MT2 por las cepas VIH-1IIIB (91-100%) P SDF-1, MIP-1α, MIP-1β y RANTES. Por lo tanto, en estos modelos de infección con cepas X4 del VIH-1, se excluye la posibilidad de que los GAGs de la leche estimulen la producción de SDF-1, que pudiera inhibir la infección por VIH-1 al competir por el correceptor CXCR4 con el virus. No se encontraron diferencias en las determinaciones del flujo de Ca2+ intracelular ni en la expresión de CD38 en las células MT2. Se observó que la desregulación de la expresión de CD4 ocasionada por el VIH-1 en las células MT2 infectadas, se revirtió con las dosis más altas de los GAGs y CS. Conclusiones. La actividad inhibitoria de los GAGs sobre la infección in vitro de células CD4+ por el VIH-1, se atribuye principalmente a su interacción directa con la glicoproteína gp120 de la envoltura viral, debido a que no se encontró que tuvieran ningún efecto significativo sobre las células CD4+, en cuanto a su estado de activación, a la expresión de los receptores para el VIH-1, ni en la producción de quimiocinas. Debido al potente efecto inhibidor que han mostrado los GAGs de la leche humana en la infección in vitro por el VIH1, podrían proponerse como candidatos a agentes microbicidas para el virus.; Introduction. HIV-1 entry into its target CD4+ cell is a process that involves multiple steps. The initial interaction of HIV-1 with the cell occurs mainly by non-specific binding to lectins, heparan sulfate proteoglycans that are protein chains linked to glycosaminoglycans (GAGs), glycolipids, or by ligand-receptor interactions of the virion with cell surface proteins. Sulfated glycoconjugates such as glycolipids and GAGs present on the surface of colonic, vaginal epithelial and neuroglial cells bind to HIV gp120 envelope glycoprotein, suggesting that these glycoconjugates may have a role in HIV entry and infection. GAGs are polyanionic polysaccharides that are found ubiquitously in cell membranes and some fluids such as human milk. Chondroitin sulfate (CS) and sulfated heparan sulfate/heparin are the main species found in human milk. Previous in vitro studies showed that human milk GAGs inhibit HIV gp120 binding to its host cell CD4 receptor and have a potent inhibitory effect on CD4+ cell infection by HIV-1 laboratory strains and primary isolates. It has also been reported that human milk decreases the expression of chemokine receptor and HIV co-receptor: CCR5 in human PBMCs, suggesting that GAGs could also have an effect on CD4+ cells that contribute to inhibiting HIV-1 infection by downregulation of CCR5 expression and preventing HIV-1 entry. Objective. To characterize the inhibitory effect of human milk GAGs on HIV-1 infection in vitro and evaluate their possible impact on human CD4+ cells.