Identificación de las isoformas de VEGF y sus receptores de membrana (VEGFR1 y VEGFR2) y solubles (SVEGFR1 y SVEGFR2) en folículos jerárquicos de gallinas - Pérez Alamilla, Heidy Ana Rosa (Universidad Autónoma Metropolitana, 2020)
The vascular endothelial growth factor (VEGF) is necessary for follicular development in several species, because its angiogenic effect, which allow the supply of nutrients, oxygen and hormones to follicular cells and oocyte of, as well release of sexual steroids into the blood vessels. Moreover, the VEGF has proliferative and cytoprotective effects on follicular cells. The VEGF gene, has 8 exons and 7 introns and result of alternative splicing in the exons 6, 7 and 8 of the immature mRNA several isoforms are synthetized. VEGF biological effects are mainly mediated by two membra receptor tyrosine-like kinase, namely VEGFR1 or Flt-1 and VEGFR2 or Flk-1. During maturation of immature mRNA of VEGF membrane receptors, two soluble isoforms, one for each receptor denoted sVEGFR1 and s VEGFR2, are formed, which have antiangiogenic effects. The objective of present study was identifying the mRNA expression of VEGF isoforms in granulosa and theca cells of hen hierarchical follicles and show if they express the membrane and soluble VEGF receptors. Likewise, to show the sequence of all the members of VEGF systems expressed. Total mRNA was extracted in a pool of granulosa and theca cells from F1 and F2 hierarchical follicles of Leghorn hens, exposed to a photoperiod of 14 h light and 10 h dark. Endpoint PCR was performed on each sample using specific primers for the four receptors and a pair of primers located in exon 4 and 8 to amplifying all the VEGF isoforms. The PCR products were run on 2% agarose gel to identify the bands corresponding to the isoforms and receptors. In the VEGF gel, five bandswere observed and cut, with an approximate size of 120, 200, 270, 350 and 450 bp. Regarding to receptors, one unique band corresponding to the amplicons of each gene were observed. After purification and cloning of these bands, in both granulosa and thecacells the presence of four isoforms of VEGF were identified, corresponding to VEGF122, VEGF146, VEGF166 and VEGF190. The faith band that we observed but not sequencing is suggested to correspond to VEGF 207. Similarly, the membrane receptors, VEGFR1 and VEGFR2 and their soluble isoforms sVEGFR1 and sVEGFR2 in granulosa and theca cells of hierarchical follicle F1 and F2 were verified.; El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es un factor importante durante el desarrollo folicular de las diferentes especies, debido a sus efectos angiogénicos, permite a las células del folículo y al ovocito recibir nutrientes, oxígeno, hormonas y facilita la liberación de esteroides hacia el torrente sanguíneo. Adicionalmente este factor de crecimiento tiene efectos citoprotectores y proliferativos en células endoteliales y no endoteliales. El VEGF está codificado por un gen compuesto por 8 exones separados por 7 intrones que como resultado de corte y empalme en los exones 6, 7 y 8 del pre ARNm se forman distintas isoformas. Los efectos biológicos de VEGF son mediados principalmente por la unión a dos receptores tipo tirosina quinasa, el VEGFR1 o Flt-1 y VEGFR2 o Flk-1. Además, por proceso de corte y empalme del ARNm de los receptores de membrana, se sintetizan dos receptores solubles denominados sVEGFR1 y sVEGFR2 los cuales ejercen un efecto anti angiogénico. El objetivo del presente estudio fue identificar la presencia de isoformas de VEGF en células de la granulosa y teca de folículos jerárquicos de gallina, así como demostrar la presencia de los receptores de membrana VEGFR1 y VEGFR2 y sus respectivas formas solubles sVEGFR1 y sVEGFR2, además de mostrar las secuencias que confirman cada uno de estos componentes del sistema VEGF. Se realizaron PCRpunto final decada muestra, para ello, se extrajo ARNm en un pool de células de la granulosa y de la teca de folículos F1 y F2 de gallinas Legohrn, expuestas a un fotoperiodo de 14 h luz y 10 h obscuridad. Se diseñaron cebadores específicos para los cuatro receptores y un par de primer ubicados en el exón 4 y 8 para observar la expresión de todas las isoformas de VEGF que se encuentren en estas células. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 2% para identificar las bandas correspondientes a las isoformas y receptores. En el gel de agarosa de isoformas de VEGF se observaron y cortaron cinco bandas, con un tamaño aproximado de 120, 200, 270, 350 y 450 pb, de acuerdo al marcador de peso molecular que se usó; en el caso de los receptores se cortaron las bandas únicas que correspondían a los amplicones de cada gen, se obtuvieron bandas de 102, 103, 129 y 79 pb. Estas bandas se sometieron a un proceso de purificación y los productos, se sometieron a clonación con un vector pUCm-T resistente a ampicilina y su posterior purificación y secuenciación. El resultado de las secuenciaciones muestra la presencia de cuatro isoformas del ligando, que correspondena VEGF 122, VEGF 146, VEGF 166, VEGF 190 y una quinta banda que no se tiene la secuenciación, pero se sugiere corresponde a VEGF 207, tantoen células de la granulosa como en células de la teca. De la misma manera se compararon las secuencias en GenBak con las obtenidas en este experimento y se comprobó la presencia dereceptores de membrana, VEGFR1 y VEGFR2 yde sus formas solubles sVEGFR1 y sVEGFR2 en células de la granulosa y teca de folículos 1 y 2 jerárquicos de gallina, así como en el hígado que fue usado como control.