Estudio de fucosidasas microbianas y su aplicación en la síntesis de oligosacáridos - Escamilla Lozano, Yolanda (Universidad Autónoma Metropolitana, 2016)
The ability of six lactic acid bacteria to produce α-L-fucosidase is reported here for first time, opening a wide field of investigation related to the metabolism and assimilation of human milk oligosaccharides by lactic acid bacteria. Lactobacillus casei IMAU60214, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus KLDS, Lactobacillus helveticus IMAU70129 and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB-2772 were all able to produce α-L-fucosidases. Growth kinetics and carbohydrate consumption measurements indicated that the six strains were able to metabolise D-glucose and D-galactose as a carbon source; surprisingly, they did not assimilate L-fucose. However, α-L-fucosidase was a cell-associated enzyme and produced constitutively in diferent carbon sources. The highest cell associated α-L-fucosidase activity was observed in L. rhamnosus GG (0.16 U/mg). It was found that the enzyme extract obtained from L. rhamnosus GG may be used for sinthetize fucosyl-oligosaccharides; however, the use of efficient purification methods for removing lactase in this extract and prevent the formation of galactooligosaccharides is suggested. Moreover, it was possible to produce recombinant T. maritime α-L-fucosidase expressed in E. coli BL21, and demonstrated that the enzyme has the ability to synthesize fucosyl-lactose when pNP-F is used as donor substrate and lactose as acceptor substrate; the highest yield was 49%. It was also found that the use of lactase from A. oryzae in combination with fermentation by Saccharomyces cerevisiae is a good alternative as purification process of fucosyl- oligosaccharide.; Este es el primer estudio que reporta las síntesis de α-L-fucosidasa en seis bacterias ácido lácticas, lo que abre un amplio campo de investigación sobre el metabolismo y la asimilación de los oligosacáridos de la leche humana por parte de estos microorganismos. Lactobacillus casei IMAU60214, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus KLDS, Lactobacillus helveticus IMAU70129 y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB-2772 fueron capaces de producir α-L-fucosidasa. Las cinéticas de crecimiento y el consumo de carbohidratos indicaron que las seis cepas fueron capaces de metabolizar D-glucosa y D-galactosa como fuente de carbono; pero no asimilaron L-fucosa. Por otro lado, las α-L-fucosidasas sintetizadas son enzimas asociadas a la célula y se produjeron de manera constitutiva en diferentes fuentes de carbono. La mayor actividad enzimática se observó en L . rhamnosus GG (0.16 U/mg). De esta manera, se comprobó que el extracto enzimático obtenido de la fermentación con L . rhamnosus GG puede ser utilizado como fuente de enzima en reacciones de transfucosilación para la obtención de fucosil-oligosacáridos. Sin embargo, se sugiere el empleo de métodos de purificación eficientes para retirar la lactasa de este extracto y evitar la formación de galactooligosacáridos. Adicionalmente, se logró producir la α-L-fucosidasa recombinante de T. marítima expresada en E.coli BL21. Se demostró que la enzima presenta capacidad de transferasa para la síntesis de fucosil-lactosa. Esto se logró cuando se empleó pNP-F como sustrato donador y lactosa como sustrato aceptor, con un rendimiento máximo de 49 %. Se comprobó que el empleo de lactasa de A. oryzae en combinación con la fermentación con Sacharomyces cerevisae representa una alternativa en el proceso de purificación del fucosil-oligosacárido.