Efecto de la regulación por pH y la expresión del factor de transcripción PacC sobre la producción de antibióticos betalactámicos en Acremonium chrysogenum - López Calleja, Alberto Cristian (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
Acremonium chrysogenum es un hongo filamentoso productor de cefalosporina C (CPC), un antibiótico beta-lactámico de amplio espectro y baja toxicidad que sirve de base para la síntesis química de todas las cefalosporinas de uso clínico. Estas características hacen de la CPC un producto de alto valor agregado. Actualmente, A. chrysogenum es el único productor de CPC a nivel industrial. La biosíntesis de CPC se encuentra regulada por diversos factores y uno de los más importantes es el pH ambiental, que ejerce su función reguladora a través del regulador global de transcripción PacC. Cuando las condiciones ambientales de pH son entre ácidas y neutras la proteína PacC se encuentra inactiva, en una conformación cerrada. Cuando las condiciones cambian de neutras a alcalinas, se desencadena una cascada de señalización por pH que resulta en el rompimiento proteolítico del factor de transcripción PacC, llevándolo a su forma activa. Una vez activo, PacC regula positivamente la transcripción de la mayoría de los genes involucrados en la biosíntesis de CPC. Varios estudios han demostrado que la producción de CPC por A. chrysogenum es más alta cuando se utilizan sistemas de cultivo en estado sólido (SSF) en comparación con sistemas sumergidos (SmF). Además, se ha observado que existe un intervalo de valores de pH que favorece la producción de CPC, tanto en SSF como en SmF. En el presente trabajo se estudiaron, desde un punto de vista molecular, las diferencias entre la producción de CPC en SSF y SmF por A. chrysogenum. Se realizó un análisis de expresión de los genes cefD2 y cefEF, que codifican para dos enzimas limitantes de la biosíntesis de CPC, y del gen cefT, que codifica para una enzima involucrada en la secreción del antibiótico; en ambos sistemas de cultivo a pH controlado. Se encontraron diferencias importantes en los niveles de transcripción de estos genes, siendo estadísticamente mayor su expresión relativa (ER) en SSF. La ER máxima del gen cefD2 en SmF fue apenas el 7.46% de la alcanzada en SSF, mientras que la del gen cefEF fue del 65.8%, y la del gen cefT del 42.4%. Estos resultados son las primeras evidencias que reportan diferencias a nivel transcripcional en los genes biosintéticos de CPC de A. chrysogenum, influenciadas por las condiciones del sistema de cultivo. Por otra parte, se activó constitutivamente el factor de transcripción PacC de A. chrysogenum, truncando el gen pacC hasta el sitio correspondiente para que su expresión diera lugar a la forma activa de la proteína, creando un fenotipo de mimetismo alcalino. La mutación se introdujo en la cepa silvestre de A. chrysogenum y en la cepa de alta producción C10 y se observaron sus efectos sobre la producción de antibióticos beta-lactámicos en dos medios diferentes de cultivo, ambos amortiguados a pH ácido. Se observaron incrementos significativos en la producción específica de antibióticos beta-lactámicos, de hasta 21.3 veces en medio definido y hasta 12.4 veces en medio complejo, por una de las mutantes de la cepa silvestre. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas de la producción en las mutantes de la cepa C10, sugiriendo que en esta cepa ya se encuentra desregulada la señalización por pH ambiental. Finalmente, se llevó a cabo la inactivación del factor de transcripción PacC en A. chrysogenum mediante la interrupción del gen pacC en la región correspondiente al dominio de unión al ADN y la señal de localización nuclear y el silenciamiento del mismo gen utilizando la tecnología del ARN interferente. La interrupción del gen resultó aparentemente letal para la cepa silvestre de A. chrysogenum. El silenciamiento del gen afectó negativamente al crecimiento en medio sólido pero no en cultivo líquido. La producción específica de antibióticos beta-lactámicos no resultó ser estadísticamente diferente en las cepas con el gen pacC silenciado en comparación con la cepa parental y la cepa control. El presente trabajo continúa con la aplicación de las herramientas moleculares para comprender más en detalle los mecanismos de regulación de la biosíntesis de CPC y persigue mejorar genéticamente la producción de este antibiótico haciendo uso de los conocimientos sobre la señalización por pH ambiental.; Acremonium chrysogenum is a filamentous fungus capable to produce cephalosporin C (CPC), a broad spectrum beta-lactam antibiotic with relatively low toxicity. CPC is mainly used to produce the whole array of cephalosporins for clinic use. A. chrysogenum is the only known CPC producing microorganism. For these reasons, CPC is a high value-added product of great clinic and industrial interest. The CPC biosynthesis pathway is regulated in several ways. Ambient pH signaling is one of the most important regulating factors. pH regulation is exerted through the general transcription factor PacC. When the pH of the culture medium is acidic to neutral, PacC is inactive. When the pH becomes alkaline a signaling cascade begins, resulting in two successive proteolytic cleavages of PacC, leading to its active form. Once it has been activated, PacC upregulates the transcription of most genes involved in CPC biosynthesis. Some studies had demonstrated that CPC production by A. chrysogenum is higher when solid-state fermentation (SSF) systems are utilized, in comparison with submerged fermentations (SmF). Furthermore, it has been observed that there is a pH range in which the CPC production is better in both systems. In this work, we studied, from a molecular point of view, the differences between SSF and SmF during CPC production. We performed an expression analysis of the cefD2, cefEF and cefT genes from A. chrysogenum. The first two encode two limiting enzymes for CPC biosynthesis, and the last encodes for a transporter protein involved in the antibiotic exportation. Both types of fermentation were made within a controlled pH interval. We found important differences at transcriptional level for the expression of these genes. In the three cases, the relative expression (RE) of the genes was statistically higher in SSF than in SmF. The highest RE for the cefD2 gene in SmF was only 7.46% of that observed in SSF, whereas the corresponding to the cefEF gene was 65.8%, and for the cefT gene was 42.4%. These results are the first evidence of the differences, at the transcriptional level, of the CPC biosynthetic genes, whose expression is influenced by the conditions of the fermentation system. On the other hand, we activated constitutively the transcription factor PacC from A. chrysogenum, by truncating the pacC gene to the site corresponding for the direct expression of the active form of the protein, creating an alkaline-mimicking phenotype. The mutation was introduced in the wild type (WT) and C10 (high producer) strains of A. chrysogenum, and its effects were observed on the beta-lactam antibiotics production, carried on two different fermentation medium buffered at acidic pH. Significant increases were observed in the specific production (SP) of beta-lactam antibiotics. For example, the P17 mutant of the WT strain, reached up to 21.3-fold the SP observed in the parental strain in a defined medium, and up to 12.4-fold in a complex medium. Nevertheless, no significant increase was observed in the SP of the C10 mutants, which suggests that this strain has already deregulated the ambient-pHsignaling pathway. Finally, we inactivated the transcriptional factor PacC in A. chrysogenum, by disrupting the pacC gene in the DNA-binding domain and the nuclear localization signal, and silenced the pacC gene by interference RNA. Disruption was apparently lethal for A. chrysogenum wild type. Silencing negatively affected the growth in solid medium but not in liquid culture. The specific production of beta-lactam antibiotics was not statistically different in pacC-silenced strains compared to the wild type and control strains. This work continues with the application of molecular tools to further understanding of the regulation mechanisms of CPC biosynthesis, and attempts to improve genetically CPC production, using the knowledge on the ambient-pH signaling.