Determinación del contenido fenólico en extractos naturales mediante sensores enzimáticos - Ibarra Escutia, Pedro (Universidad Autónoma Metropolitana, 2010)
En este trabajo se describe el desarrollo y optimización de biosensores amperométricos basados en La casa de Trametes versicolor (LTV) o Tirosinasa de hongos (TM) ;así como su aplicación para determinar el contenido de compuestos fenólicos en tés y extractos de uvas. Los estudios electroquímicos realizados incluyen diferentes técnicas como voltamperometría cíclica (VC), voltamperometría de pulso diferencial (VPD) y amperometría, empleando SPE´s modificados con LTV o TM, ambas enzimas del grupo de las polifenoloxidasas (PPO). Con el propósito de comparar el desempeño de biosensores construidos usando dos métodos diferentes, TM fue inmovilizada primero por reticulado con glutaraldehído y posteriormente por atrapamiento usando alcohol polivinilico PVA-AWP (Azide-unit pendant water-soluble). En ambos métodos se utilizaron electrodos impresos de grafito (SPE)y se evaluaron diferentes cantidades de enzima sobre la superficie del electrodo de trabajo. Adicionalmente se analizaron y optimizaron otras condiciones experimentales en base al esquema del diseño factorial para 3 factores (temperatura, pH y potencial aplicado) y una vez determinadas las condiciones experimentales óptimas se realizó el análisis de extractos de uvas y distintas infusiones herbales. Los resultados muestran que el biosensor modificado con tirosinasa (TM-SPE) inmovilizada en PVA-AWP, supera al biosensor construido porreticulado. La enzima LTV también es estudiada utilizando los mismos métodos de inmovilización. Se realizó también la optimización de los biosensores en términos de pH, temperatura y potencial aplicado. Se determinó el intervalo de linealidad, límite de detección, estabilidad operacional y estabilidad al almacenamiento. El biosensor modificado con lacasa (LTV-SPE) fue calibrado usando o-, m-, p-difenol y ácido caféico. La respuesta más alta se encontró utilizando amortiguador de acetatos 0.1 M de pH 4.7y 30°C. El tiempo de vida del biosensor se estima en más de seis meses. Por otra parte el biosensor modificado con tirosinasafue calibrado únicamente para catecol y para ácido caféico, ambos en amortiguador 0.1 M de fosfatos pH 7.0. LTV-SPE fue utilizado para la determinación del contenido fenólico equivalente (CFE) en infusiones de tés mientras que el biosensor TM-SPE fue utilizado para determinar el CFE en extractos de uvas. El biosensor modificado con LTV muestra mayor sensibilidad y estabilidad en comparación con otros sensores enzimáticos reportados en la literatura. La principal ventaja de los dispositivos propuestos, radica en la facilidad del método de fabricación y de análisis pues las mediciones se realizan mediante la adición directa a la celda electroquímica de pequeños volúmenes de las muestras reales. En conclusión se considera que la inmovilización de las enzimas LTV y TM sobre SPE’s permite la construcción de biosensores que muestran buen desempeño analítico quepueden usarse como un método rápido y confiable para determinarel contenido fenólico, el cual puede vincularse a la capacidad antioxidante de los extractos naturales.; Amperometric biosensors based on Laccase from Trametes versicolor (LTV) orTyrosinase from mushrooms(TM) weredeveloped and optimized for monitoring the phenolic compounds content in tea infusionsand grapes extracts. With the aim of comparing the performances of the biosensors developed using two different methods, TM was immobilizedfirstly bycross-linking with glutaraldehyde and afterward by entrapment in a polymeric film using polyvinyl alcohol photopolymer PVA-AWP (Azide-unit pendant water-soluble) both of them onto disposable graphite screen-printed electrodes (SPE), evaluating at the same time, different amount of enzyme fixed on the working electrode surface. Sincethe obtained results show thatthe performance of the TM-SPE manufactured by entrapment withinPVA-AWPis better than cross-linking, a different enzyme is evaluated also entrapped in the same polymeric film.LTVwasimmobilized onto disposable graphite screen-printed electrodes (SPE)to construct a second type of biosensor. Sensitivity optimization in terms of pH, temperature and applied potential was carried out. The linear range, detection limit, operational and storage stabilities were also determined.The laccase biosensor(LTV-SPE)was calibrated for o-, m-and p-diphenol as well as caffeic acid.The highest response was found at 0.1 M acetate buffer pH 4.7, though it must be added the good reproducibility and operational stability were also obtained. The useful lifetime of the biosensor is estimated to be greater than 6 months.Whereasthe tyrosinasebiosensor (TM-SPE)was calibrated only for its natural substrate o-diphenol (catechol) and caffeic acid at 0.1 M phosphate buffer pH 7.0.LTV-SPE was used for the determination of the equivalent phenol content in tea infusions whereas TM-SPE was used to determine the equivalent phenol content in grapes extracts, both of them by the direct additionof small sample into the electrochemical cell;the results were compared with those from the Folin-Ciocalteu spectrophotometric method.The amperometric detection exhibits some interesting advantages such as high simplicity, minimal sample preparation and shorter response time. A stable and sensitive amperometric response was obtained toward standard diphenolic compounds, grapes extracts and herbal infusions. In conclusion both types of biosensors are useful for easy and fast monitoring of equivalent phenol content that can be related to the antioxidant capacity of natural extracs.