Diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSCs) en cardiomiocitos a partir de co-cultivo indirecto: proliferación celular y expresión de proteínas cardíacas - Gómez Quintero, Teresa (Universidad Autónoma Metropolitana, 2018)
El campo de la ingeniería de tejidos se proyecta como una de las opciones más prometedoras dentro de las ramas de la medicina regenerativa, para la generación o reconstitución de órganos y tejidos en la aplicación clínica. La fabricación de implantes autólogos funcionales para uretra, vejiga, esófago y piel a partir de combinar células madre derivadas de tejido adiposo o de médula ósea combinadas con andamios biocompatibles, son los ejemplos representativos del potencial clínico de la disciplina. Sin embargo, la fabricación de órganos complejos como riñón, pulmón, hígado y corazón aún representa un reto tecnológico considerable; comenzando por la fuente de obtención de células autólogas altamente especializadas que tales órganos requieren. La disponibilidad de órganos para trasplante se ve reducida ante la carencia de donaciones, el bajo porcentaje de órganos que pueden ser trasplantados y los problemas de histocompatibilidad, aunado al riesgo de rechazo y pérdida del órgano trasplantado; por lo que el desarrollo de diferentes proyectos de investigación que buscan mejorar o brindar una mejor alternativa al procedimiento actual de trasplante va en auge. Las principales vertientes tecnológicas abordadas para solventar la demanda creciente de órganos y tejidos se centran en el desarrollo de mejores biomateriales para injerto y cultivo celular, la bioimpresión en 3D de estructuras celulares, los xenotrasplantes, la descelularización y repoblación de matriz extracelular de órganos y tejidos. De todas, esta última, se ha convertido en una de las opciones más atractivas para la obtención de tejidos u órganos debido a que preserva la mayoría de los componentes estructurales de la matriz extracelular y elimina la mayor parte de los componentes con ADN del donador; teniendo mejores condiciones para la adhesión de las células del futuro receptor y menor riesgo de incompatibilidad. Los modelos animales y cadavérico humano explorados con esta técnica han mostrado resultados importantes; sin embargo, la repoblación de los tejidos se realiza con cultivos primarios (cuya obtención y expansión está limitada para varios tipos celulares, entre ellos, miocitos cardíacos). Obtener un gran número de células autólogas para repoblar la matriz extracelular del órgano se convierte en una condición necesaria para producir órganos complejos: riñón, pulmón o corazón, por ejemplo. Se han reportado diversos protocolos para la inducción de células madre (derivadas de médula ósea o de tejido adiposo), todavía no está establecido un método que permita dicha transformación eficientemente. El método reportado más efectivo es el de Co-Cultivo directo: poniendo células madre derivadas de tejido adiposo (ADSCs) en contacto directo con células de cultivo primario, en proporciones desiguales, donde los cardiomiocitos nativos superan por mucho la cantidad de células madre por diferenciar. Este método tiene grandes inconvenientes para la aplicación clínica de los injertos, pues requiere de perfeccionar el método de separación de ambas poblaciones celulares y presenta una complicación extra al tratarse de un cultivo primario de tejido cardíaco o pulmonar (donde la toma de biopsia confiere un riesgo alto para el paciente tratado o el donante). Materiales y métodos. Este trabajo se centró en la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSCs) de conejo en células musculares cardíacas a través de Co-Cultivo indirecto (utilizando un medio condicionado para cardiomiocitos); con el objetivo de averiguar si este tipo de células madre pueden ser transformadas a musculares cardíacas a través de las condiciones de cultivo en comparación con otro método previamente reportado en el mismo modelo, donde se utiliza un fármaco anticancerígeno, 5-Azacitidina, y se verificó la presencia de proteínas cardíacas. Se consideraron 4 grupos experimentales para el análisis: ADSCs sin tratamiento (control negativo); 8 tejido nativo (control positivo); ADSCs tratadas con 5-Azacitidina y ADSCs tratadas por Co-Cultivo indirecto. Se comparó la expresión de proteínas musculares α-actina, miosina y desmina (con tinción por inmunocitoquímica); y la expresión de troponina cardíaca T y conexina 43 como marcadores del linaje cardíaco (con tinción por inmunofluorescencia para el primer marcador, y citometría de flujo para el segundo). Esto para ADSCs sin tratamiento, ADSCs tratadas con 5-Azacitidina y ASDCs en Co-Cultivo indirecto; tomando tejido cardíaco nativo como control positivo. Se evaluó la tasa de proliferación y viabilidad celular de las ADSCs en tratamiento, comparando con las células madre del grupo control, a través de un ensayo MTT. Resultados. Los resultados obtenidos indican que ambos tratamientos; 5-Azacitidina así como el CoCultivo indirecto, mostraron la expresión de proteínas diferentes a las expresadas en el grupo de ADSCs del grupo control. Tanto para proteínas musculares, como específicas cardíacas. El método de Co-Cultivo indirecto fue el más eficiente para la diferenciación, dado que mostró expresión de tres proteínas musculares (α-actina, miosina y desmina) y dos proteínas específicas cardíacas (troponina T y conexina 43), en comparación con la expresión en el grupo de ADSCs tratadas con 5-Azacitidina. Además de mostrar una tasa de proliferación celular controlada. La principal diferencia entre ADSCs tratadas con 5-Azacitidina y las ADSCs en Co-Cultivo indirecto se observó en el análisis por citometría de flujo para Conexina 43; el porcentaje de expresión del grupo tratadas con Azacitidina fue 6%, en comparación con el porcentaje de expresión de las ADSCs en Co-Cultivo de 16%, equiparable a la expresión del tejido nativo, 14%. Conclusión. Respecto a las proteínas analizadas y la tasa de proliferación de los grupos, se pudo concluir que, bajo nuestras condiciones de aislamiento y cultivo celular, el método de Co-Cultivo indirecto es más eficiente para la transformación de ADSCs en células musculares cardíacas respecto al tratamiento con 5-Azacitidina. Resaltando como método eficiente para la obtención de células autólogas diferenciadas tipo cardiomiocito; Introduction. The field of tissue engineering is projected as one of the most promising options, within the branches of regenerative medicine, for the generation or reconstitution of organs and tissues for clinical application. The fabrication of functional autologous implants for urethra, bladder, esophagus and skin from combining stem cells derived from adipose tissue or bone marrow combined with biocompatible scaffolds, are representative examples of the clinical potential of the discipline. However, the manufacture of complex organs such as kidney, lung, liver and heart still represents a considerable technological challenge; starting from the source of obtaining highly specialized autologous cells that such organs require. The availability of organs for transplant is reduced due to the same lack of donations, the low percentage of organs that can be transplanted and the present histocompatibility problems, together with the risk of rejection and loss of the transplanted organ; so, it is necessary the development of different research projects that seek to improve or provide a better alternative to the current transplant procedure. The main technological aspects addressed to solve the growing demand of organs and tissues are focused on the development of better biomaterials for grafting and cell culture, 3D bioprinting of cellular constructs, xenotransplantation, decellularization and repopulation of extracellular matrix of organs and tissues. Of all, the latter, has become one of the most attractive options for obtaining tissues or organs because it preserves most of the structural components of the extracellular matrix and removes most of the components with donor DNA; having better conditions for the adhesion of the cells of the future recipient and lower risk of incompatibility. The animal and cadaverous human models explored with this technique have shown important results; however, repopulation of the tissues is carried out with primary cultures (which obtain and expand for several cell types is limited, including cardiac myocytes). Obtaining many autologous cells to repopulate the extracellular matrix of the organ becomes a necessary condition to produce complex organs: kidney, lung or heart, for example. Although several protocols have already been reported for the induction of stem cells (derived from bone marrow or adipose tissue), a method that allows such transformation efficiently is not yet established. The most effective method reported is that of direct Co-Culture: by placing stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) in direct contact with cells of primary culture, in unequal proportions, where native cardiomyocytes far outnumber the number of stem cells to be differentiated. This method has great disadvantages for the clinical application of grafts, because it confers perfecting the method of separation of both cell populations and has the extra complication since it is a primary culture of cardiac or pulmonary tissue (where the biopsy sample itself confers a risk high for the treated patient or the donor). Materials and methods. This work focused on the differentiation of rabbit stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) in cardiac skeletal muscle cells through indirect Co-Culture (using a conditioned medium for cardiomyocytes); with the aim of finding out if this type of stem cells can be transformed to cardiac skeletal muscle through culture conditions, compared to another method previously reported with the use of an anticancer drug, 5-Azacitidine, where the presence of cardiac proteins was verified. Four experimental groups were considered for the analysis: ADSCs without 10 treatment (negative control); native tissue (positive control); ADSCs treated with 5-Azacitidine and ADSCs treated by indirect Co-Culture. The expression of muscle proteins α-actin, myosin and desmin was compared (using immunocytochemistry staining); and cardiac troponin T and connexin 43 expression as markers of specific cardiac lineage (using immunofluorescence staining for the first marker, and flow cytometry for the second). This for ADSCs without treatment, ADSCs treated with 5-Azacitidine and ADSCs in indirect Co-Culture; taking native heart tissue as a positive control. The rate of cell proliferation and viability of the ADSCs under treatment was evaluated, comparing with the stem cells of the control group, through an MTT assay. Results. The results obtained indicate that both treatments; 5-Azacitidine as the indirect Co-Culture, show expression of proteins different from those expressed in the ADSCs of the control group, both for muscle and cardiac proteins. The indirect Co-Culture method was the most efficient for differentiation, since it showed expression of the three muscle proteins and both cardiac proteins, in comparison with the expression in the group of ADSCs treated with 5-Azacitidine. They also showed a controlled cell proliferation rate. The main difference between ADSCs treated with 5-Azacitidine and the ADSCs in indirect Coculture was observed in the flow cytometry analysis for Connexin 43; the percentage of expression of the group treated with Azacitidine was 6%, in comparison with the percentage of expression of the ADSCs in Co-Culture of 16%, showing levels comparable to the expression of the native tissue, 14%. Conclusion. Regarding the proteins analyzed and the proliferation rate of the groups, we can conclude that, under our isolation and cell culture conditions, the indirect Co-Culture method is more efficient for the transformation of ADSCs into cardiac muscle cells with respect to treatment with 5Azacitidina. Highlighting as an efficient method to obtain cardiomyocyte-type autologous differentiated cells