Evaluación de las interacciones electrostáticas en complejos enzima-inhibidor: la triosafosfato isomerasa con inhibidores fosforilados - Serratos Álvarez, Iris Natzielly (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
En este trabajo se caracterizó la energética de unión de la enzima triosafosfato isomerasa de levadura de Saccharomyces cerevisiae (ScTIM) a diferentes fuerzas iónicas y temperaturas, con dos de sus inhibidores más afines: el 2-fosfoglicolato (2PG) y fosfoglicolohidroxamato (PGH). Se determinaron los parámetros termodinámicos del proceso de unión: Ku, ΔGu, ΔHu, ΔSu y ΔCp en presencia de concentraciones crecientes de NaCl por titulaciones fluorimétricas (TF) y calorimétricas. La titulación calorimétrica fue a través del método convencional (CTI) y por un nuevo método llamado calorimetría de titulación multitérmica (CTM), el cual permite medir el ΔCp en un sólo experimento. Se descartó una posible interacción específica de los iones Na+ y Cl- con la enzima nativa, considerando que al aumentar la concentración de NaCl las transiciones térmicas de desplegamiento se desplazaron a temperaturas más bajas. Al aumentar la fuerza iónica (I) los parámetros termodinámicos Ku, ΔGu y ΔHu, se hacen menos favorables y ΔSu menos desfavorable, lo que indica que las interacciones carga-carga son importantes en la asociación. De la variación de Ku con I, se determinó la contribución electrostática al ΔGu, siendo el 36% y 26% para la formación del complejo ScTIM-2PG y ScTIM-PGH respectivamente, a I= 0.06 M y 25 º C. La afinidad de unión de PGH para ScTIM es mayor y se debe a un ΔHu más favorable comparado con la unión de 2PG (por 19-24 kJ mol-1, a 25 ° C), de acuerdo al análisis de las estructuras cristalográficas de ambos complejos hay una diferencia de cinco puentes de hidrógeno entre 2PG y PGH que podría explicar parte de la energética de unión. Las entalpías de unión de la ScTIM con ambos inhibidores (ΔHu) fueron las mismas medidas en presencia de trietanolamina y en PIPES, por lo que se descartaron cambios netos de protonación en el medio debido a la unión de los inhibidores. La interacción ScTIM-inhibidor esta acompañada por un ΔCp negativo, el cual se hace menos negativo al aumentar la fuerza iónica. Los valores de ΔCp determinados a I = 0.06 M fueron mucho más negativos que los valores predichos por los modelos de área superficial. Como se ha demostrado en otros sistemas, este ΔCp negativo puede explicarse por moléculas de agua secuestradas en la interfase cuando los inhibidores se unen a la proteína. Los parámetros termodinámicos de unión para el complejo ScTIM-2PG cambiaron más bajo el efecto de la fuerza iónica, en comparación con los valores obtenidos para el complejo ScTIM-PGH. Está mayor dependencia es consistente con los equilibrios acoplados de protonación necesarios para producir la especie dianiónica de 2PG que se une a la TIM, procesos no requeridos para la unión de PGH. En términos de ΔGu, los valores obtenidos experimentalmente se compararon con las energías calculadas teóricamente a partir de las contribuciones electrostática (energía de solvatación y energía coulómbica) y no electrostática. Los valores de ΔGu experimentales y teóricos no corresponden de manera exacta, sin embargo, se observó que en ambas evaluaciones la afinidad de los complejos ScTIM-inhibidor disminuyó al aumentar la fuerza iónica del medio. Además en el ΔGu teórico no se consideran los efectos entrópicos rotacionales y traslacionales. Para el complejo ScTIM-2PG se realizó una aproximación considerando la entropía rotacional y traslacional, determinando un TΔS=-31.5 kJ mol-1. Este efecto se le adicionó al ΔGu teórico a I = 0.06 M y se obtuvo un valor de -79 kJ mol-1, el cual es más cercano al ΔGu,intr. = -41.05 kJ mol-1 determinado a partir de los equilibrios de acoplados de protonación. Por otro lado, se realizó un análisis sobre el efecto de las cargas de algunos residuos en la asociación ScTIM-inhibidor y su impacto en la contribución electrostática a la energía de unión. Al cambiar la carga de algunos átomos de la Lys12 y del Glu165 de la ScTIM, así como las cargas del grupo fosfato de los inhibidores, el ΔGu siempre fue desfavorable, por lo que las interacciones electrostáticas que se establecen entre la proteína y los inhibidores parecen ser indispensables para la unión.; In this work, we characterized the binding energetics of yeast triosephosphate isomerase (ScTIM) with two phosphorylated inhibitors: 2-phosphoglycollate (2PG) and phosphoglycolohydroxamate (PGH) at different ionic strengths and temperatures. We determined the thermodynamic parameters of the binding process: Kb, ΔGb, ΔHb, ΔSb and ΔCp in presence of different concentrations of NaCl, through fluorimetric titrations and calorimetric ones in the conventional mode of ITC, and using a novel method called multithermal titration calorimetry, MTC, which allows to measure ΔCp in a single experiment. Considering that increasing concentrations of NaCl shifted the circular dichroism (CD) thermal scans of ScTIM to lower temperatures, we ruled out a possible specific interaction of ions Na+ and Cl- with the native enzyme. Increasing the ionic strength (I) causes Kb, ΔGb and ΔHb became less favorable while ΔSb turned less unfavorable, indicating that charge-charge interactions are important in the association. From the variation of Kb with I, we determined the electrostatic contribution to ΔGb, being 36% and 26% for ScTIM−2PG and ScTIM−PGH, respectively, at I = 0.06 M and 25 ºC. The greater affinity of PGH for ScTIM is due to a more favorable ΔHb as compared with 2PG (by 19–24 kJ mol-1, at 25 °C). This difference is compatible with up to five more hydrogen bonds PGH establishes with ScTIM. Binding enthalpy of ScTIM for both inhibitors (ΔHb) were the same when measured in triethanolamine and in PIPES, hence linked protonation effects were discarded. Both binding ΔCp were negative, becoming less negative with increasing ionic strength. ΔCp at I = 0.06 M were much more negative than values predicted by surface area models. This highly negative ΔCp could be explained by water molecules trapped in the interface when ligands bind to protein. Thermodynamic binding functions for the ScTIM−2PG complex changed more with ionic strength, as compared with those from the ScTIM−PGH couple. This greater dependence is consistent with linked, but compensated, protonation equilibriums to yield the dianionic species of 2PG that binds to ScTIM, processes not required in the case of PGH. The ΔGu values were compared with the sum of calculated energies as electrostatic (solvation and coulombic energy) and non-electostatic contributions. These values were not similar; however, in both ScTIM-inhibitor complexes the affinity became less favorable with increasing ionic strength. Theoretical ΔGu did not consider rotational and traslational entropic effects. For ScTIM-2PG complex an approach was made considering the rotational and translational entropy, determining a TΔS =- 31.5 kJ mol-1. This effect was added to theoretical ΔGu at I = 0.06 M being -79 kJ mol-1, which is closer to ΔGu, intr = -41.05 kJ mol-1 determined by considering protonation equilibriums. On the other hand, the calculated binding energy became unfavorable when Lys12 and Glu165 charges of ScTIM were turned off, as well as with charges of the phosphate group of the inhibitors, evidencing the essential role these charges play in the binding process.