Establecimiento de cultivos de callo de Erigeron canadensis y evaluación de su actividad antioxidante y antimicrobiana Público Deposited
Erigeron canadensis es una especie vegetal de la cual no se han explorado a profundidad los compuestos químicos que es capaz de producir, dado que es una especie que ha sido catalogada como invasora en Europa y Asia, situación que ha llevado a investigar sus formas de control más que sus propiedades medicinales, entre las cuales se encuentran reportados sus efectos antimicrobianos, antioxidantes, antiinflamatorios, anticancerígenos, entre otras. Por otra parte, en México es una especie nativa que no ha sido investigada por sus efectos medicinales, a pesar de ser empleada en el tratamiento tradicional de fiebre y problemas estomacales. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer cultivos in vitro de callo de la especie para estandarizar la producción de los compuestos encontrados en la planta silvestre y determinar la actividad biológica de los extractos orgánicos de polaridad creciente de hojas y tallos de la planta silvestre mexicana. Para ello, el material vegetal se colectó en el Estado de Morelos, se realizó la identificación taxonómica, y posteriormente se estableció el cultivo in vitro de callos para la extracción de compuestos bioactivos. Los extractos obtenidos de la planta silvestre fueron analizados por CCF (cromatografía en capa fina), GC-MS (cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas) y HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución), mientras que los extractos de los cultivos de callo se analizaron por CCF. Además, se realizó la evaluación del potencial antioxidante, antibacteriano y antifúngico in vitro de los extractos de la planta silvestre, así como la evaluación del efecto cicatrizante en un modelo in vivo, no realizada anteriormente. El medio de cultivo MS sólido permitió la germinación de un 67-100% de las semillas desinfectadas con etanol 70% y NaClO 0.1%, para la inducción de callo se tomaron explantes de hoja, internodo y raíz de las plántulas obtenidas, dichos explantes se inocularon en medio MS sólido con los RCV (PIC, KIN, BAP), mediante la aplicación de un diseño experimental de 18 tratamientos, destacando el explante de internodo y los tratamientos T5 (0.1 mg/L PIC + 1.0 mg/L BAP) y T6 (0.1 mg/L PIC + 2.0 mg/L BAP) que indujeron callo friable capaz de sobrevivir los subcultivos consecutivos en un 96.75% y 87.5%, respetivamente. Los tratamientos T5 y T6 fueron sometidos a cambios en su composición de la fuente de carbono (sacarosa 3 y 5% p/v y glucosa 3% p/v) y porcentaje de sales basales del medio MS (100, 75, 50 y 25% p/v) con la finalidad de mejorar la friabilidad del callo y reducir su oxidación, observándose mayor producción de biomasa a los 21 días de cultivo cuando el medio MS se encuentra al 100% de su concentración en las fuentes de carbono empleadas (sacarosa al 3 y 5 %, glucosa al 3%) y mayor consistencia friable en los tratamientos con sacarosa y glucosa al 3%. Paralelamente, se exploró la fitoquímica de la planta silvestre, se obtuvieron extractos seriados en polaridad creciente (n-hexano, acetato de etilo y metanol) de las hojas y los tallos, lo que permitió comparar la producción de compuestos por órgano de la planta (CCF y HPLC) e identificar los compuestos menos polares y su abundancia relativa (GC-MS), entre los que se encuentran el fitol, cubebeno, farneseno, diferentes ácidos grasos y la 8-metilcumarina, que no ha sido reportada con anterioridad para la especie. Estos compuestos podrían estar presentes también en las líneas de callo debido a que los perfiles por CCF de la planta silvestre y líneas de callo exhiben compuestos mayoritarios similares. En cuanto a la actividad biológica de los extractos orgánicos de la planta silvestre, destaca el extracto de tallo de polaridad media a 1000ppm que muestra efecto antioxidante mediante la prueba de DPPH. Mientras que el extracto de hoja de polaridad media presenta la CMI más baja, de 62.5 µg/mL contra Streptococcus pyogenes, el extracto de tallo de polaridad baja fue el único que inhibió Pseudomonas aeruginosa y el de polaridad media inhibió Staphylococcus aureus (incluida una cepa resistente) con un CIM de 500 µg/mL y de 125 µg/mL, respectivamente, los extractos de hoja de polaridad baja y media tuvieron actividad antifúngica (Candida albicans), particularmente el extracto de polaridad baja a 100 mg/mL muestra el halo de mayor tamaño (20.02mm) y similar al del control positivo (Fluconazol). No se demostró la actividad cicatrizante de los extractos de tallo de polaridad alta y de hoja de polaridad media. Finalmente, se concluye que E. canadensis posee propiedades medicinales que requieren ser investigadas a mayor profundidad y continuar la investigación fitoquímica para determinar los compuestos responsables de las actividades biológicas observadas, así como la investigación biotecnológica para mantener la producción estable de compuestos de interés e investigación de compuestos producidos in vitro, además de evaluar la actividad biológica de los extractos de callo, ya que su composición química podría ser distinta a la de la planta silvestre y por tanto variar en su actividad biológica.
Erigeron canadensis is a plant species whose chemical compounds have not been investigated in depth since it is considered an invasive species in Europe and Asia, situation that has already led to research into its growth control rather than its medicinal effects, among which its antimicrobial, antioxidant, anti-inflammatory, cytotoxic and other effects were reported. Besides, in Mexico it is a native species that has not been investigated for its medicinal effects, despite being used in traditional medicine to treat fever and stomach illnesses. The objective of this study was establishing in vitro callus cultures of this species to standardize the production of compounds founded in the wild plant and determine the biological activity of the organic extracts of growing polarity from leaves and stems of Mexican wild plant. For this purpose, the plant material was collected in Morelos State, it has been used in the taxonomic identification, and subsequently the establishment of in vitro callus cultures for the extraction of bioactive compounds. The extracts obtained from the wild plant were analyzed by CCF (thin layer chromatography), GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) and HPLC high performance liquid chromatography), while the extracts from callus were analyzed by TLC. In addition, the evaluation of the antioxidant, antibacterial and antifungal potential in vitro of the wild plant was carried out, as well as the evaluation of wound healing effect in an in vivo model, not previously carried out. The solid MS medium allowed the germination of 67-100% of seeds disinfected with 70% ethanol and 0.1% NaClO, for callus induction, leaf, internode and root explants were taken from seedlings obtained. These explants were inoculated in MS solid media with plant growth regulators (PIC, KIN, BAP), through an experimental design of 18 treatments, highlighting the internode explant and the treatments T5 (0.1 mg/L PIC + 2.0 mg/L BAP) and T6 (0.1 mg/L PIC + 2.0 mg/L BAP) for its ability to induce callus capable of survive consecutive subcultures in 96.75% and 93.33%, respectively. The treatments T5 and T6 were subjected to changes in their carbon source (sucrose and glucose) and MS salt concentrations (100, 75, 50 and 25%) to improve its friability and reduce oxidation, greater biomass production was observed after 21 days of culture when MS medium is at 100% of its salts in every carbon source (sucrose 3 and 5%, glucose 3%), also the friability were higher in treatments with sucrose and glucose at 3%. In parallel, the phytochemistry of the wild plant were explored, serial extracts of increasing polarity (n-hexane, ethyl acetate and methanol) were obtained from leaves and stems, which allowed us to compare the production of organic compounds by TLC and HPLC and identified the least polar compounds and their relative abundance by GC-MS, among which are phytol, cubebene, farnesene, different fatty acids and 8-methylcoumarin, which has not been previously reported for the species. These compounds could also be present in the callus cultures because the TLC profiles of the wild plant and callus exhibit similar mainly compounds. Regarding the biological activity of the organic extracts of the wild plant, the medium polarity stem extract at 1000 ppm has antioxidant effect through DPPH. While the medium polarity leaf extract has the lowest MIC of 62.5 µg/mL against Streptococcus pyogenes, the low polarity stem extract was the only one that inhibit the growth of Pseudomonas aeruginosa and the medium polarity stem extract inhibits Staphylococcus aureus with MICs of 500 and 125 µg/mL, respectively, the low and medium polarity leaf extracts had antifungal activity against Candida albicans, particularly the low polarity extract at 100 mg/mL showed an inhibition halo of 20.02 mm, similar to positive control (Fluconazole). The wound healing effect were not demonstrated to high polarity steam extract and medium polarity leaf extract. Finally, it is concluded that E. candensis has medicinal properties that require further investigations and continued the phytochemical research to determine the compounds responsible for the observed biological effects, as well the biotechnological research to maintain the stable production of bioactive compounds and investigate the compounds produced in vitro, as well as evaluate the biological activity of callus extracts, because its chemical composition could be different to the wild plant, so the biological activity could be different too.
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