Efecto de las sobreexpresión del gen lovE sobre la fisiología de Aspergillus terreus, en fermentación sólida y líquida - Martínez Velasco, Agustín Daniel (Universidad Autónoma Metropolitana, 2012)
El hipercolesterolemico lovastatina se produce en forma convencional por fermentación líquida por Aspergillus terreus, aunque últimamente se ha utilizado la fermentación sólida (FS), un nuevo sistema que involucra un material inerte como soporte y muestra una productividad sorprendente. Una desventaja de la fermentación sólida, sin embargo, es la falta de cepas especiales, eficientes en este sistema. Por lo anterior, en esta tesis se pretende desarrollar métodos para mejoramiento genético de cepas para FS. Una estrategia avanzada para generar cepas sobreproductoras de metabolitos es el incremento del número de copias y la sobreexpresión de un gen regulador positivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar la estrategia de incrementar el número de copias del gen lovE (gen regulador específico de los genes de biosíntesis lovastatina) y comprobar su efecto sobre la producción de lovastatina en FS y en FL. Para ello, se transformó A. terreus con el gen lovE, bajo el control de un promotor constitutivo (gpd de A. nidulans). Sin embargo, como el vector usado, pAN52.1, carece de un marcador para hongos fue necesario utilizar un proceso de cotransformación con el vector pULC43. Se obtuvieron 36 transformantes totales y como un paso de preselección, se evaluó la producción de lovastatina de las transformantes por Fermentación en Cilindro de Agar (FCA), obteniéndose que, solamente 10 incrementaban la producción con respecto a la parental, mientras que el control (transformada solamente con los vectores pULC43 y pAN52.1 pero sin el inserto lovE) mantuvo una producción ligeramente inferior a la de la parental. Así, se caracterizó a las 10 transformantes preseleccionadas en FCA, midiendo su producción en FS y FL al séptimo día. En FS solamente dos transformantes, de las 10 evaluadas, fueron sobreproductoras. La T11 mostró un incremento de producción de lovastatina de 60.48 %, llegando a una producción de 23.27 mg de lovastatina/gms. Y siguió la T08, con incremento de 37.17% (19.89 mg/gms).; Desde el punto de vista de la eficiencia del método de mejoramiento genético, se observa que de treinta y seis transformantes aisladas originalmente solamente 2 fueron realmente sobreproductoras en fermentación sólida, dando una eficiencia de obtención relativamente baja (11.11%). Probablemente, el sistema de cotransformación utilizado le quitó eficiencia a este método. Sin embargo, también es evidente que la técnica de preselección con FCA le agregó eficiencia a la estrategia general. Se constató que con poco esfuerzo, el uso de la FCA permitió de entrada desechar 26 transformantes y concentrar el esfuerzo en las 10 transformantes que mostraron mayor producción que la parental. De esta manera, la integración de la FCA como parte del método subiría la eficiencia al 40%. Es decir, 40% de las cepas preseleccionadas resultaron sobreproductoras, lo cual es un porcentaje notablemente alto para un método de mejoramiento genético. En FL, el panorama fue similar, con cuatro transformantes sobreproductoras de las 10 preseleccionadas. No obstante, es importante notar que, aunque la T11 fue la mejor en FS y en FL, las demás mostraron comportamiento diferente en FS y en FL. Por ejemplo, la T08, que fue la segunda mejor en FS, en FL bajó la producción en 16.56%. De esta manera, en FL la T11 tuvo un incremento en la producción de lovastatina de 40.69%, llegando a una producción de 0.875 mg/mL, la T26 mostró un aumento de 26.84% (1.111 mg/mL) y la T23 un incremento de 18.08% (1.034 mg/mL). Con la información del Southern blot disponible, se concluyó que todas las transformantes, confirmadas con copia(s) adicional(les) de lovE, fueron sobreproductoras de lovastatina en uno u otro sistema de cultivo. Desde el punto de vista básico, se observó que la sobreexpresión de lovE no tuvo un efecto claro sobre la morfología. Sin embargo, los resultados mostraron que sí incide negativamente en la conidiación. No hay ningún antecedente similar en la literatura y es poco probable que LovE pueda interaccionar con promotores relacionados con esporulación. Sin embargo es posible que LovE interactúe con elementos de la cascada de señalización cAMP-PKA.