Efecto del incremento de la dosis génica (GENES pcbC Y penDE) en Penicillium chrysogenum sobre la producción de penicilina G en fermentación líquida y sólida - Leyva Contreras, Juan Carlos (Universidad Autónoma Metropolitana, 2000)
Los avances en ingeniería genética están dando forma a un nuevo estilo de mejoramiento genético. Se ha intentado una de las estrategias de mejora en la producción de penicilina: el aumento en la dosis de los genes pcbC y penDE en Penicillium chrysogenum implicados en los dos últimos pasos de la vía biosintética. Se obtuvieron transformantes P. chrysogenum derivados de la cepa P2-32 (de alta producción) y Wisconsin 54-1255 (de baja producción) utilizando al vector de clonación construido para probar el efecto de introducir una o más copias extras de estos dos genes pcbC y penDE en ambas cepas recipientes. En la construcción de este vector bifuncional fueron incluidas secuencias de ADN del plásmido pC43, como el origen de replicación colEl, el gen Cm para la resistencia al cloranfenicol y el módulo para la resistencia a fleomicina. Un fragmento de ADN de 5.1 kpb flanqueado por secuencias para reconocimiento de la enzima SaZI fue obtenido del plásmido pJL33. Este fragmento contiene a los dos genes de interés y se ligó dentro del Único sitio para la enzima Sal1 del pC43, lo cual permitió crear al vector de expresión nombrado pUAMJC1. Se empleó el sistema de selección por resistencia a fleomicina para la transformación de P. chrysogenum. El sistema de transformación resultó ser el doble de lo efectivo para la cepa de alta producción (28 transformantes recuperados del medio) que para la cepa de baja producción (1 3 clones resistentes). El 50 % de los transformantes derivados de la cepa Wisconsin 54-1255 (TW) presentaron resistencias a la fleomicina de 40 a 60 pg/mL. Mientras que los originados de la cepa P2-32 (TP) 30 % de los transformantes adquirieron resistencias de 50 a 80 pg/mL. L Los transformantes TP generaron en promedio zonas de inhibición mayores (34 mm) a los TW (20 mm), en bioensayos por cobertera. Con este método, se apreció una correlación directa entre el tamaño de halo y el grado de resistencia adquirida a fleomicina, correlación más definida para los transformantes TW. De tal forma que el porcentaje promedio de aumento en la producción de penicilina G en medio por cobertera, llevada a cabo por los transformantes TW fue de 80 a 100 YO en comparación a la cepa sin transformar y, de 25 a 29 Y para los clones TP. El método de cobertera aplicado para la selección de transformantes mejorados fue un sistema válido que se puso a punto, tiene un grado aceptable de fiabilidad, la variabilidad de los valores es pequeña y es un ensayo repetitivo y representativo con los resultados de FL. El 45 YO de los transformantes TW y 30 Yo de los TP exhibieron una relación directa entre la resistencia a la fleomicina y la cantidad de penicilina generada. Dos de los tres transformantes TW analizados, adquirieron porcentajes de incremento en la producción específica de penicilina G que van del 116 al 224 % en FL con respecto a la cepa parental; y un clon TP generó un porcentaje de incremento del 48 %. El nivel de producción específica en FL alcanzado por las colonias TW en general fue parecido al de los clones TP. A diferencia de la FL, ninguno de los transformantes evaluados en la FS fueron capaces de obtener porcentajes de incremento importantes en los niveles de producción específica de penicilina G con respecto a las cepas parentales. Los transformantes TP presentaron producciones especificas ligeramente superiores a los TW en FS. Los niveles de producción de penicilina de los transformantes TW y TP en FS fueron, respectivamente, 2.5 y 3.5 veces superiores al alcanzado en FL y, la producción específica obtenida por ambos transformantes fue casi del doble en FL que en FS.