Análisis in vitro e in silico de proteínas intracelulares con efecto antimicrobiano producidas por Pediococcus pentosaceus 1101 - Ramos Palma, Arquímedes (Universidad Autónoma Metropolitana, 2024)
Lactic Acid Bacteria (LAB) are present in fermented meat products, the most representative genera are Lactobacillus and Pediococcus, which provide stability and prolong their useful life because they can produce compounds with antimicrobial activity, such as bacteriocins and bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS), recent studies have also shown that proteins like peptidoglycan hydrolases (PHG) and ribosomal proteins exhibit antimicrobial activity. In previous work, Juárez (2019) conducted doctoral research within the W-207 Laboratory group under the supervision of Dr. Edith Ponce Alquicira at UAMIztapalapa, in which various LAB of Spanish-type chorizo were isolated. one of them was strain 1101, which demonstrated the inhibition of microorganisms associated with food spoilage and exhibited high anti-Listeria activity. The objective of this work was to identify in sillico the possible metabolites of protein origin that cause the antimicrobial effect of strain 1101. The strain under study was identified as Pediococcus pentosaceus by amplification of the 16S rRNA reference gene, with a similarity percentage of 97%. Additionally, identification was confirmed through the analysis of the protein profile using mass spectrometry (MALDI-TOF-Biotyper), providing a result of high confidence. the strain under study is named Pediococcus pentosaceus 1101. Subsequently, the antimicrobial activity against Listeria innocua was evaluated using the cell-free supernatant of the culture, as well as the intracellular fraction obtained through a mechanical disruption lysis process. The remnants of the lysed cells exhibited higher antimicrobial activity, so the analysis of the intracellular fraction was continued. Modifications were made to the optimal growth conditions of strain 1101 to assess potential variations in the antimicrobial activity of the intracellular fraction, temperatures of 30ºC and 44ºC, pH 5 and 6, and addition of 1% yeast extract to the base culture médium were tested. Lysis was performed, recovering and concentrating the proteins through precipitation with trichloroacetic acid and dithiothreitol, followed by washes with acetone. The electrophoretic profile and zymogram of the intracellular fraction, conducted on Tris-tricine polyacrylamide gels, revealed 5 bands with inhibitory activity against Micrococcus lisodeikticus, with apparent weights of 14.08, 42.83, 52.84, 70.89, and 103.42 kDa under the growth condition of 44°C. In the bioinformatic analysis, the apparent weights obtained were used to identify potential proteins associated with inhibitory activity. Proteins were searched in the NCBI database using keywords related to antimicrobial activity of peptidoglycan hydrolases (PGH) and similar weights. Subsequently, the results were filtered based on intracellular and transmembrane localization using the Psortb tool. The sequences of the chosen proteins were obtained, aligned for primer design, and then subjected to product simulation. In this exercise, proteins were searched in 33 sequenced genomes reported in NCBI for Pediococcus pentosaceus.The simulation results suggest that the proteins with antimicrobial activity belong to the M13 peptidase family, associated with various functions such as signaling and cell membrane permeabilization.; Las Bacterias ácido lácticas (BAL) se encuentran presentes en alimentos fermentados de origen cárnico, los géneros más representativos son Lactobacillus y Pediococcus, que proporcionan estabilidad y prolongan su vida útil debido a que son capaces de producir compuestos con actividad antimicrobiana como las bacteriocinas y el grupo llamado sustancias inhibidoras similares a bacteriocinas (BLIS), recientemente se ha demostrado que proteínas como las peptidoglucano hidrolasas (PHG) y ribosomales presentan dicha actividad. En trabajos previos, Juárez Castelán (2019) realizó su trabajo de tesis doctoral dentro del grupo de trabajo del Laboratorio W-207 dirigido por la Dra. Edith Ponce Alquicira en la UAM-Iztapalapa, en el cual se aislaron diversas BAL de chorizo tipo español capaces de inhibir a microorganismos asociados al deterioro de alimentos, destacando la cepa Pediococcus pentosaceus 1101 que demostró una alta actividad antilisteria. Debido a que existen diversos reportes de péptidos con actividad antimicrobiana producidas por bacterias del género Pediococcus, este trabajo tuvo como objetivo identificar in silico los posibles metabolitos de origen proteico con efecto antimicrobiano secretados por la cepa de estudio. En primera instancia se corroboró la identidad de la cepa 1101 mediante la amplificación del gen de referencia 16S ARNr, con un porcentaje de similitud para Pediococcus pentosaceus superior al 97%. Asimismo, se realizó la identificación mediante el análisis del perfil proteico por espectrometría de masas (MALDI-TOFBiotyper) con un resultado de alta confianza. Posteriormente se evaluó la actividad antimicrobiana de la cepa en estudio contra Listeria innocua haciendo uso del sobrenadante libre de células del cultivo, así como la fracción intracelular obtenida a través de un proceso de lisis por disrupción mecánica. Los restos de las células lisadas mostraron mayor actividad antimicrobiana, por lo que se continuó con el análisis de la fracción intracelular. Se realizaron modificaciones a la condición óptima de crecimiento de la cepa 1101 para saber si existe una variación de la actividad antimicrobiana de la fracción intracelular, se probaron temperaturas de 30ºC y 44ºC, pH 5 y 6, y adición de 1% de extracto de levadura sobre la base del medio de cultivo. Se realizo la lisis recuperando y concentrando las proteínas por precipitación con ácido tricloroacético y ditiotreitol, seguido de lavados con acetona. El perfil electroforético y zimograma de la fracción intracelular realizada en geles de poliacrilamida Tris-tricina mostraron 5 bandas con actividad inhibitoria contra Micrococcus lisodeikticus con pesos aparentes de 14.08, 42.83, 52.84, 70.89 y 103.42 kDa en la condición de crecimiento de 44ºC En el análisis bioinformático los pesos aparentes obtenidos se usaron para identificar las posibles proteínas asociadas a la actividad inhibitoria, se buscaron proteínas reportadas en la base de datos de NCBI mediante palabras clave asociadas con actividad antimicrobiana de PGH y similares al peso, para después filtrar por localización intracelular y transmembranal haciendo uso de la herramienta Psortb. Se obtuvieron las secuencias de las proteínas elegidas, se les realizó un alineamiento para el diseño de primers y posterior simulación de productos, para este ejercicio se buscaron las proteínas en 33 genomas secuenciados y reportados en NCBI de Pediococcus pentosaceus. Los resultados obtenidos de la simulación siguieren que las proteínas con actividad antimicrobiana pertenecen a la familia de peptidasas M13 asociadas con diversas funciones de señalización y permeabilización de membrana celular