Estudios para la producción de una lacasa termoestable por el hongo Trametes sp. EUM1 - Márquez Ortega, Ángel Eduardo (Universidad Autónoma Metropolitana, 2006)
En este trabajo se estudió el efecto que tiene la fuente de nitrógeno en la expresión de las distintas lacasas del hongo termo tolerante Trametes sp. EUM1. También se identificó en cuales extractos existían las isoformas con mayor estabilidad térmica. Este estudio radica en la necesidad de encontrar condiciones de cultivo favorables para la producción de isoformas de la enzima lacasa que tengan propiedades de gran importancia para los procesos industriales o biotecnológicos (la producción de pigmentos, degradación de la lignina o de compuestos fenólicos y sus derivados, entre otros). Por esta razón, se han buscado, identificado y clonado genes de la enzima lacasa en diversos géneros de microorganismos, incluyendo el género Trametes. En una primera etapa, se propagó la cepa de Trametes sp. EUM1 en medio Kirk líquido, con dos diferentes fuentes de nitrógeno (Tartrato de amonio y Peptona de caseína), y se analizó la actividad y el patrón de producción de lacasas. La actividad enzimática se determinó mediante la oxidación del ABTS (ácido 3-etilbenzo-tiazolin6-sulfonico) como sustrato y se obtuvo un valor máximo de actividad lacasa de 47 UE/L en el medio con peptona. Una vez confirmados estos datos, se realizó el ensayo de termotolerancia de los extractos enzimáticos provenientes del medio Kirk con peptona, comparándose con una enzima comercial (Novo). Los resultados de esta prueba mostraron que después de una incubación de una hora a 60° C, el extracto enzimático, medido a temperatura ambiente, conservó una mayor actividad residual (hasta un 85%) con respecto a la enzima comercial (58% de actividad residual). Además, el hongo Trametes sp. EUM1 produjo al menos una isoforma de lacasa termoestable a 70° C, debido a que mantuvo el 35% de su actividad después de una hora de incubación. Este resultado fue confirmado por medio de zimogramas en condiciones nativas. El ensayo mostró una banda enzimática termoestable similar a banda de la enzima comercial, pero, con un peso molecular aproximado de 50 kDa. Por otro lado, se observó que la fuente de nitrógeno tiene efecto sobre la actividad lacasa y la expresión de las isoformas. A partir de anterior, se extrajo el ARNT del medio Kirk con peptona de caseína de los días que presentaron una mayor producción de lacasas termoestables (días 5, 6 y 7) para la generación de una genoteca de ADNc del hongo Trametes sp. EUM1, la cual mostró un valor de titulación de 9.20x107 pfu/mL, siendo aceptable el resultado según la bibliografía. Se obtuvo una sonda a partir de un fragmento amplificado del ADN genómico de Trametes sp. EUM1, con un tamaño de 324 pb y que pertenece a un gen de lacasa, según el resultado correspondiente a su secuencia. Finalmente se realizó la hibridación de la genoteca con la sonda, para rastrear los fragmentos correspondientes a un gen de lacasa y de esta forma se seleccionaron 20 colonias de bacteriófago λ con inserción de distintos fragmentos en su ADN. Desafortunadamente, ninguna de las secuencias mostró que los fragmentos pertenecieran a un gen de lacasa. La conclusión principal de este trabajo es: la fuente de nitrógeno (peptona vs. tartrato de amonio) tiene un efecto muy marcado en la producción y expresión de isoformas termoestables de la enzima lacasa del hongo termo tolerante Trametes sp. EUM1, porque la adición de peptona se asoció con mayor actividad de una banda electroforética de lacasa termoestable. Además, se logró la construcción de una sonda que facilitó la clonación e identificación de un fragmento de ADN genómico del hongo perteneciente a un gen de lacasa. Este avance es necesario para lograr, en un futuro, la clonación de una enzima termoestable de este organismo