Identificación de la diversidad microbiana de Coffea arabica y coffea canephora en los diferentes métodos de cultivo y de procesamiento mediante secuenciación masiva de nueva generación y la prevalencia de ocratoxina A en café de Chiapas - Aguilar Álvarez, María Eugenia (Universidad Autónoma Metropolitana, 2022)
Ochratoxin A (OTA) is a threat to health due to its toxicity. OTA is produced by fungi of the genera Aspergillus and Penicillium in different stages of coffee processing. The degree of contamination depends on the weather, humidity, geographical location and the kind of post-harvest processing. Chiapas is the primary producer of conventional and organic arabica coffee. Mexico is the second-largest producer of organic coffee globally and eleventh in conventional coffee production. To date, there have been no studies on the incidence of OTA in coffee produced and marketed in Chiapas, so during the 2017/2018 cycle, we took 100 samples of Chiapas coffee and classified them according to variety (arabica or robusta), type (roasted or non-roasted), post-harvest processing (dry or wet) and cultivation system (organic or conventional). The average OTA concentration in 97 % of the samples was 0.41 ± 0.62 μg/kg. OTA was not detected in 52% of the samples; in 45%, the concentration varied between 0.05 and 3.4 μg/kg, below the limit of the European standard (<5 μg/kg). In only 3% of the samples did OTA values exceed the standard. It was also found that the prevalence of OTA in Chiapas coffee depends on the variety, type, and processing (p ≤ 0.05). The OTA found in organically and conventionally grown coffee presented no significant statistical differences. The average OTA in the 14 samples of instant coffee (from national production) was 0.93 ± 0.71 μg/kg and showed a higher likelihood of finding OTA than in the Chiapas coffee studied. These results suggest that the prevalence of OTA in Chiapas coffee is low and is less likely to be found in wet-roasted arabica coffee. Microbial diversity was analyzed using next-generation sequencing (NGS) from fresh ripe cherries and both wet and dry processing methods at different drying times, in three coffee-growing regions in Chiapas (Cruz del Rosario, from Las Margaritas, Nuevo Anexo Ojo de Agua, from Independencia and Santo Domingo, from Unión Juárez, Chiapas), during the 2018-2019 cycle. The OTA present in 26 coffee samples was quantified, the metagenomic DNA was extracted, and the 16S ribosomal gene and ITS region were analyzed. A set of strains from the genera Lactobacillus, Bacillus and Weissella were identified in fresh cherries and wet-processed coffee, and enterobacteria and yeasts such as Pichia, Candida and Wickerhamomyces. Species diversity was higher in dry processing, and other genera were found, including Corynebacterium, Lysinibacillus, Acetobacter and Pantoea. An abundance of the genus Penicillium and, to a lesser degree, Aspergillus was also found in these samples. Conversely, Aspergillus was the most abundant genera in the wet-processed samples. The OTA concentration in 97.7% of the samples presented in a range of 0.0-3.4 µg/kg OTA, i.e. within the European standard (≤ 5 µg/kg). In these samples, the presence of Lactobacillus and Pichia was abundant, which may account for the low concentration of OTA since it has been reported that these bacteria inhibit the development of ochratoxigenic fungi and OTA production. The highest concentration of OTA (15.7 µg/kg) was found in the dry Arabica cherries at 15 days of drying. In this sample, Penicillium ornatum was the most abundant (94%). One important finding was that in all the coffee samples studied, no filamentous fungi with ochratoxigenic potential were identified, which may explain the low OTA concentration. The bacterial and fungal diversity was analyzed through alpha and beta indices. The bacterial population was observed to be the most abundant and diverse and presented significant differences according to the processing type and sampling location (p<0.05). The alpha index presented no significant differences between variety, processing type, sampling location or cultivation system in fungal population. Nevertheless, significant differences were found in the beta index of the fungal communities based on sampling location and processing type (p<0.05). This study allows a wider comprehension of the coffee from Chiapas and may result in a referent for the analysis and further research considering the complex biotechnological chain around each type of post-harvest coffee processing. Also, it brings a possibility to improve the quality of coffee and seize the potential of the different bacterial and fungal communities to control the levels of OTA and the fungi quantity that produces this mycotoxin.; La Ocratoxina A (OTA) es una amenaza para la salud por su toxicidad. Es producida por hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, en diferentes etapas del procesamiento del café. El grado de contaminación depende de factores como el clima, la humedad, la localización geográfica, tipo de procesamiento postcosecha. Chiapas es el principal productor de café arábica convencional y orgánico. Y México ocupa el onceavo lugar en la producción de café convencional y el segundo lugar de café orgánico a nivel mundial. A la fecha no hay estudios sobre la incidencia de la OTA en el café producido y comercializado en Chiapas, por lo que en el ciclo 2017/18 se adquirieron 100 muestras de café de Chiapas, se clasificaron según su variedad (arábica o robusta), tipo (tostado o no tostado), procesamiento postcosecha (seco o húmedo) y sistema de cultivo (orgánico o convencional). En 97 muestras analizadas la OTA promedio fue de 0.41 ± 0.62 μg/kg. No se detectó OTA en el 52%; en el 45% la concentración osciló entre 0.05 y 3.4 μg/kg, por debajo del límite de la norma europea (<5 μg/kg), solo en el 3% de las muestras los valores de OTA rebasaron la norma. Se encontró también que la prevalencia de la OTA en el café chiapaneco depende de la variedad, tipo y procesamiento (p ≤ 0.05). La OTA presente en el café cultivado orgánica y convencionalmente no presentó estadísticamente diferencias significativas. El promedio de OTA en las 14 muestras de café soluble (de producción nacional) fue de 0.93 ± 0.71 μg/kg y tuvo mayor probabilidad de encontrar OTA que el café de Chiapas estudiado. Estos resultados sugieren que la prevalencia de OTA en el café de Chiapas es baja y que es menos probable que se encuentre en el café arábica tostado y procesado en húmedo. Mediante secuenciación masiva de nueva generación (NGS) se analizó la diversidad microbiana presente en café a partir de la cereza madura fresca y, procesado por los métodos seco y húmedo, en diferentes tiempos de secado, en tres regiones cafetaleras de Chiapas (Cruz del Rosario, de las Margaritas, Nuevo Anexo Ojo de Agua, de la Independencia y Santo Domingo, de Unión Juárez, Chiapas), durante el ciclo 2018/19. Se cuantificó la OTA presente en 26 muestras de café, se les extrajo el ADN metagenómico y se analizó el gen ribosomal 16S y la región ITS. En las cerezas frescas y en el café procesado por el procesamiento húmedo se identificó un conjunto de bacterias de los géneros Lactobacillus, Bacillus y Weissella, además de enterobacterias y levaduras como Pichia, Candida y Wickerhamomyces. Durante el procesamiento seco la diversidad de especies fue mayor y se encontraron otros géneros como Corynebacterium, Lysinibacillus, Acetobacter y Pantoea. También en estas muestras se identificó de manera abundante el género Penicillium y en menor porcentaje Aspergillus. Un comportamiento contrario se observó en las muestras procesadas por el método húmedo en donde Aspergillus fue el más abundante. La concentración de OTA en el 97.7% de las muestras analizadas presentaron un rango entre 0.0-3.4 µg/kg de OTA, es decir, que cumplen con la norma europea (≤0.5µg/kg). En estas muestras la presencia de Lactobacillus y Pichia fue abundante y es posible que favorezcan la baja concentración de OTA ya que ha sido reportado que inhiben el desarrollo de hongos ocratoxigénicos y la producción de OTA. La concentración más alta de OTA (15.7 µg/kg) se encontró en la muestra de cereza seca arábica con 15 días de secado. En esta muestra, Penicillium ornatum fue el más abundante (94%). Un hallazgo importante fue que en todas las muestras de café estudiadas no se identificaron hongos filamentosos con potencial ocratoxigénico lo que posiblemente contribuye a la baja concentración de OTA. La diversidad bacteriana y fúngica fue analizada mediante los índices alfa y beta. Se observó que la población bacteriana fue más abundante y diversa y presentó diferencias significativas según el tipo de procesamiento y lugar de muestreo (p<0.05). El índice alfa en las poblaciones fúngicas no presentó diferencias estadísticas significativas entre la variedad, tipo de procesamiento, lugar de muestreo, tipo de cultivo. No obstante, si se encontraron diferencias significativas en el índice beta de las comunidades fúngicas según el lugar de muestreo y tipo de procesamiento (p<0.05). Este estudio permite tener una comprensión amplia del café de Chiapas, y podría ser un referente para el análisis e investigaciones posteriores considerando todo la compleja cadena biotecnológica en cada tipo de procesamiento postcosecha para mejorar la calidad del café. Además, aprovechar el potencial de las distintas comunidades bacterianas y fúngicas para el control de la contaminación de la OTA y los hongos que la producen.