Evaluación del potencial antiinflamatorio de α-amirina y lupeol en la línea celular de macrófagos RAW 264.7 y en el modelo murino de edema por TPA - García García, Sergio David (Universidad Autónoma Metropolitana, 2022)
La inflamación es un proceso fisiológico protector que se activa en respuesta a una agresión físico-química para el restablecimiento del tejido afectado. En la inflamación, los macrófagos juegan un papel crítico mediante la producción de citocinas. Una respuesta inflamatoria excesiva y prolongada puede conducir a enfermedades asociadas al síndrome metabólico, cardiovasculares, respiratorias, digestivas o autoinmunes. En el mercado existen medicamentos antiinflamatorios que causan efectos adversos cuando se consumen por periodos prologados. Lo anterior justifica la búsqueda de nuevos compuestos antiinflamatorios. En la medicina tradicional mexicana existe una gran diversidad de especies vegetales con diferentes usos antiinflammatorios. Hibiscus sabdariffa, conocida popularmente como jamaica o flor de hibisco, se utiliza como agente antiobesidad y para el tratamiento de la diabetes. Entre los principales compuestos identificados en H. sabdarifa se encuentran α-amirina y lupeol (reportados como agonistas a PPARδ/γ), los cuales pueden estar relacionados con efectos antiinflamatorios, sin embargo, no se ha profundizado al respecto. Con la finalidad de esclarecer el mecanismo de acción de estos compuestos, el presente trabajo evalúa estas moléculas triterpenoides en un modelo in vivo inflamatorio agudo de TPA, en un modelo in vitro de macrófagos y en estudios in silico de acoplamiento molecular. Objetivo Evaluar el efecto y actividad antiinflamatorios de α-amirina y lupeol en modelos in vivo, in vitro y estudios in silico. Objetivos particulares 1. Evaluar el efecto antiinflamatorio de α-amirina y lupeol en un modelo de inflamación aguda in vivo (TPA). 2. Caracterizar la expresión de citocinas (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-10) en cultivo de macrófagos tratados con α-amirina y lupeol. 3. Determinar las concentraciones de citocinas (IL-6, TNFα, IL-1β, IL-10) en sobrenadantes de macrófagos RAW 264.7 tratados con α-amirina y lupeol. 4. Evaluar la interacción de α-amirina y lupeol con la COX-2 mediante análisis de acoplamiento molecular. Materiales y métodos Modelo in vivo Se utilizaron ratones macho de la cepa CD-1 normales, a los que se les indujo inflamación tópica mediante la administración de TPA (acetato de 12-Otetradecanoil-forbol) (2.5 µg) en la oreja; posteriormente se administraron los compuestos α-amirina y lupeol (1 mg/oreja), utilizando como control positivo indometacina (1 mg/oreja). Modelo in vitro Se cultivaron macrófagos de la línea celular RAW 264.7, los cuales fueron estimulados con LPS (5 µg/mL) para inducir una respuesta inflamatoria; posteriormente se trataron con los compuestos α-amirina y lupeol (10 µM), utilizando como control positivo celecoxib (10 µM). Al final de los tratamientos la expresión del ARNm de TNF-α, IL-6, IL-1β e IL-10 se cuantificó por qPCR, y las concentraciones de las citocinas TNF-α, IL-6, IL-10 y MCP-1 en el medio de cultivo se determinaron por la técnica de ELISA. Modelo in silico Se realizo el acoplamiento molecular con la versión 4.2.6 del programa AutoDock utilizando el código de proteína 5JW1 del Protein Data Bank (PDB), resolución 2.81 Å para COX2. Mediante el programa computacional UCSF Chimera, la proteína 5JW1 fue minimizada, se le agregaron las cargas y retiraron las moléculas de agua. α-amirina y lupeol se construyeron mediante el programa Chembiodraw y se minimizaron (MMFF94) con el programa auxiliar Chem3D. A continuación, se llevó a cabo el docking molecular mediante el programa Autodock. Los cálculos de acoplamiento se realizaron con AutoDock versión 4.2.6, que realiza un acoplamiento automatizado de los ligandos con flexibilidad diédrica especificada por el usuario dentro de un sitio de unión rígida de proteínas. El programa realizó varias ejecuciones (100) en cada experimento de acoplamiento. Cada ejecución proporcionó una posición predicha en el modo de acoplamiento en el sitio alostérico de inhibición de COX-2. Resultados Los resultados mostraron en el modelo de TPA que ambos compuestos α-amirina y lupeol inhibieron significativamente el desarrollo del edema auricular, en un 68% con respecto al grupo control; y un 55% respecto al grupo tratado con indometacina. En macrófagos RAW 264.7 los compuestos disminuyeron significativamente en un 37.5% la expresión de TNF-α, IL-6 e IL-1β, así como la concentración de MCP1 en el cultivo con respecto al grupo de LPS. Por otra parte, los compuestos aumentaron significativamente en un 50% la expresión y concentración de IL-10 con respecto al grupo de LPS. Las imágenes 3D y 2D del acoplamiento molecular del celecoxib (inhibidor específico de COX-2), lupeol y α-amirina en el sitio alostérico de COX2 revelan que se unen con una ΔG= - 10.71 Kcal/mol (100/100 conformaciones), ΔG= - 6.67 Kcal/mol (43/100 conformaciones) y ΔG= - 8.43 Kcal/mol (21/100 conformaciones) respectivamente. Conclusión La administración de α-amirina y lupeol disminuyen significativamente el desarrollo del edema provocado por TPA. El efecto antiinflamatorio que ejercen ambos compuestos puede estar asociado a un descenso general de citocinas proinflamatorias y un aumento de citocinas antiinflamatorias. Además, el mecanismo de acción farmacológica puede asociarse con una interacción química con la COX-2. α-amirina y lupeol representan una alternativa importante de moléculas multi blanco, ya que además de ser agonistas duales de PPARs ejercen un efecto antiinflamatorio, a lo cual representa una ventaja terapéutica para enfermedades metabólicas con carácter inflamatorio.; Inflammation is a protective physiological process that is activated in response to a physical-chemical aggression for the restoration of the affected tissue. In inflammation, macrophages play a critical role by producing cytokines. An excessive and prolonged inflammatory response can lead to diseases associated with metabolic, cardiovascular, respiratory, digestive, or autoimmune syndrome. In the market there are anti-inflammatory drugs that cause adverse effects when consumed for prolonged periods. This justifies the search for new antiinflammatory compounds. In traditional Mexican medicine there is a great diversity of plant species with different anti-inflammatory uses. Hibiscus sabdariffa, popularly known as hibiscus or hibiscus flower, is used as an anti-obesity agent and for the treatment of diabetes. Among the main compounds identified in H. sabdarifa are α-amyrin and lupeol (reported to PPARδ/γ agonists), which may be related to anti-inflammatory effects, however, this has not been deepened. To clarify the mechanism of action of these compounds, the present work evaluates these triterpenoid molecules in an acute inflammatory in vivo model of TPA, in an in vitro model of macrophages and in silico studies of molecular coupling. Objective To assess the effect and anti-inflammatory activity of α-amyrin and lupeol in vivo, in vitro and in silico studies. Objectives 1. To assess the anti-inflammatory effect of α-amyrin and lupeol in an in vivo acute inflammation (APR) model. 2. Characterize the expression of cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-10) in culture of macrophages treated with α-amyrin and lupeol. 3. To determine cytokine concentrations (IL-6, TNFα, IL1β, IL-10) in RAW 264.7 macrophage supernatants treated with α-amyrin and lupeol. 4. To evaluate the interaction of α-amyrin and lupeol with COX-2 by molecular coupling analysis. Materials and methods In vivo model Male mice of the normal CD-1 strain were used, which were induced topical inflammation by administering TPA (12-O-tetradecanoyl-phobol acetate) (2.5 μg) in the ear; Subsequently, the compounds α-amyrin and lupeol (1 mg/ear) were administered using indomethacin (1 mg/ear) as a positive control. In vitro model Macrophages from the RAW 264.7 cell line were cultured and stimulated with LPS (5 μg/mL) to induce an inflammatory response; subsequently treated with the compounds α-amyrin and lupeol (10 μM), using celecoxib (10 μM) as a positive control. At the end of the treatments the expression of mRNA of TNF-α, IL-6, IL1β and IL-10 was quantified by qPCR, and the concentrations of the cytokines TNF-α, IL-6, IL-10 and MCP-1 in the culture medium were determined by the ELISA technique. In silico model Coupling was performed with version 4.2.6 of the AutoDock program using the protein code 5JW1 from the Protein Data Bank, resolution 2.81 Å for COX2. Using the UCSF Chimera computer program, the 5JW1 protein was minimized, the charges were added to it and the water molecules were removed. α-amyrin and lupeol were constructed using the Chembiodraw program and minimized (MMFF94) with the Chem3D auxiliary program. Next, molecular docking was carried out using the Autodock program. Coupling calculations were performed with AutoDock version 4.2.6, which performs automated coupling of ligands with user-specified dihedral flexibility within a rigid protein binding site. The program performed several runs (100) on each docking experiment. Each execution provided a predicted position in the coupling mode at the allosteric COX2 inhibition site. Results The results showed in the TPA model that both compounds α-amyrin and lupeol significantly inhibited the development of atrial edema, by 68% compared to the control group; and 55% compared to the group treated with indomethacin. In RAW 264.7 macrophages the compounds significantly decreased by 37.5% the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β, as well as the concentration in an MCP-1 in the culture with respect to the LPS group. On the other hand, the compounds significantly increased by 50% the expression and concentration of IL-10 with respect to the LPS group. 3D and 2D images of the molecular coupling of celecoxib (specific COX2 inhibitor), lupeol and α-amyrin at the allosteric site of COX-2 reveal that they bind with a ΔG= - 10.71 Kcal/mol (100/100 conformations), ΔG=-6.67 Kcal/mol (43/100 conformations) and ΔG= - 8.43 Kcal/mol (21/100 conformations) respectively. Conclusion Administration of α-amyrin and lupeol significantly decrease the development of edema caused by TPA. The anti-inflammatory effect exerted by both compounds may be associated with a general decrease in proinflammatory cytokines and an increase in anti-inflammatory cytokines. In addition, the mechanism of pharmacological action may be associated with a chemical interaction with COX2. α-amyrin and lupeol represent an important alternative of multi-target molecules, since in addition to being dual agonists of PPARs they exert an antiinflammatory effect, which represents a therapeutic advantage for metabolic diseases with inflammatory character.