Evaluación de la actividad clorogenato hidrolasa de cepas de hongos filamentosos aisladas de la pulpa de café - Pacheco Martínez, Claudia Karina (Universidad Autónoma Metropolitana, 2020)
La cafeticultura en México es de gran relevancia social, económica y ambiental, durante el 2018 las zonas cafetaleras abarcaron 712 mil hectáreas. México es el onceavo productor mundial de café. Esta producción genera desechos como la pulpa de café (PC), se estima que se generan más de medio millón de toneladas de este subproducto al año, lo que representa un gran problema de contaminación si la PC no es tratada en forma adecuada. Por lo mencionado anteriormente en esta tesis se plantea la utilización de la PC para la producción de metabolitos con actividad biológica, así como la producción de enzimas con actividad clorogenato hidrolasa apartir de hongos filamentos del género Aspergillus, y la caracterización enzimática, a través de las constantes cinéticas Km y Vmax. Durante la primera etapa experimental se evaluó la posible actividad clorogenato hidrolasa para Aspergillus niger (A. niger) CBA16-6 y Aspergillus niger (A. niger) CBR 16-4, usando extracto de café verde como fuente de ácido clorogénico (ACL) y como única fuente de carbono, se determinó que tenían la capacidad de hidrolizar el ACL y crecer, se midieron los halos de hidrólisis encontrando valores de 1.15 para A. niger CBA16-6 y 1.19 para A. niger CBR 16-4. En la siguiente fase experimental se observó que la cepa A. niger CBR 16-4 presenta la mayor velocidad de crecimiento radial con un valor de 0.049 cm/h. Posteriormente se hizo una caracterización morfológica de las cepas fúngicas seleccionadas. Se determinó la relación longitud/diámetro (L/D) de la hifa y se comprobó que las dos cepas tenían relaciones L/D grandes con valores de 10.05 para A. niger CBA 16-6 y 9.29 para A. niger CBR16-4. En la caracterización de la PC con extractos metanólicos se encontró una mayor concentración de ACL de 2-4 mg /g materia seca (MS) y en la hidrólisis alcalina se encontró una concentración de ACL de 0.95-1.04 mg /g MS seguida de una concentración de ácido cafeico (AC) de 0.62-0.65 mg /g MS. Las dos cepas seleccionadas se cultivaron en medio sólido se encontró que en la PC adicionada de glucosa para ambas cepas se alcanzaron tasas de producción de CO2 altas 3.1-5.5 mg CO2/h g MS después de 40 h de cultivo aproximadamente. Durante la siguiente etapa experimental se produjo extracto enzimático usando agrolita como soporte y un medio de cultivo definido como sustrato con extracto de café verde con ACL como única fuente de carbono, encontrando una reducción de la tasa de producción de CO2 de 2.7 a 2.9 mg CO2/ h g MS a tiempos de fermentación de cultivo más cortos 11 a 16 h respectivamente. Los extractos enzimáticos se analizaron por HPLC encontrando que el ACL disminuye a lo largo de la fermentación hasta las 36 horas a este tiempo deja se disminuir para mantenerse constante. Por su parte el AC aumenta al ser hidrolizado para posteriormente disminuir al ser consumido. En las reacciones enzimáticas se utilizó extracto enzimático producido a 12 y 24 h de cultivo a un tiempo de reacción de 60 min, para las reacciones enzimáticas se prepararon soluciones de ACL con una concentración que va de 1.10 x 10-2 a 28.22 mmol obtenido valores Km de 1.1 x10-2 – 1.64 (mmol) y Vmax de 0.2-0.75 nkatal/g MS.; Coffee farming in México is of great social, economic and environmental relevance, during 2018 the coffee growing areas covered 712 thousand hectares, Mexico is the 11 th largest coffee producer in the. This production generates by products such as coffee pulp (CP). It is estimated that more than half a million tons of this by-product are produced per year, this represents a great contamination problem if the CP is not treated property Due to the aforementioned in this thesis, the use of CP for the production of metabolites with biological activity as well as the production of enzymes with chlorogenate hydrolase activity, from filamentous fungi of the genus Aspergillus, and enzymatic laization, through kinetic constants Km and Vmax. During the first experimental stage, the possible chlorogenate hydrolase activity was evaluated for A. niger CBA 16-6 and A. niger CBR16-4, using green coffee extract as a source of chlorogenic acid (CGA) and the sole carbon source, selecting strains that have the ability to hydrolyze the CGA and use them as a source. of carbon, hydrolysis halos were measured and found values of 1.15 for A. niger CBA16-6 and 1.19 for A. niger CBR 16-4. The A. niger CBR 16-4 strain has the highest radial growth rate with a value of 0.049 cm/h. Subsequently, a morphological characterization of the selected fungal strains was made. Their length / diameter (L/D) ratio of the hypha was determined and it was verified that the two strains have large L/D ratios with values of 10.05 for A. niger CBA 16-6 and 9.29 for A. niger CBR16-4. In the characterization of the CP, a higher concentration of CGA of 2-4 mg / g of dry matter (DM) is found in methanolic extraction, and in the alkaline hydrolysis, a CGA concentration of 0.95-1.04 mg / g of DM is found, along with a caffeic acid (CA) concentration of (0.62-0.65 mg / g DM). The two selected strains were grown in solid medium and were found that in the CP with added glucose, high CO2 production rates (3.1-5.5 mg CO2 / h g DM) were reached after approximately 40 h of culture for both strains. During the second stage, an enzymatic extract was found using agrolite as a solid support and a culture medium defined as a substrate with green coffee extract as the only carbon source, finding a reduction in the CO2 production rate of (2.7-2.9 mg CO2 / hg MS) at shorter culture fermentation times (11-16 h). The enzymatic extracts were analyzed by HPLC, finding that CGA concentration decreases throughout the fermentation, but remains constant from 36 to 48 h. On the other hand, CA increases as a result the CGA hydrolysis and subsequently decrease when consumed. In the enzymatic reactions, enzymatic extract produced at 12 and 24 h of culture were found at a reaction time of 60 min, the concentration of CGA was varied from 1.10 x 10-2 to 28.22 mmol obtained Km values of 1.1x10 -2 - 1.64 mmol and Vmax 0.2-0.75 nkatal/g MS.