Análisis de la variabilidad genética en cepas de Trichinella spiralis obtenidas de caballos de dos regiones geográficas de México - Uribe Gutiérrez, Gabriel (Universidad Autónoma Metropolitana, 2007)
Trichinellosis is a parasitic disease caused by the nematode Trichinella, its affects more than 150 animal species including man. It’s transmitted mainly by the ingestion of raw or bad cooked infected pork meat; although, the horses can also transmit the infection. The mode of transmission of this parasitosis in herbivores and the parasite genetic diversity are under intensive investigation. Trichinellosis is an emergent or reemergent zoonosis, in several regions of the world and it’s considered a public health problem because affects to 11 million people around worldwide. Taxonomic classification of the parasite is complicated because all species of Trichinella have little morphological differences, besides the identification of Trichinella isolates is difficult because of the biological variability and genetic polymorphism observed in isolates from different geographic origins and host. Up to now, eight species and three genotypes have been identified. In Mexico, only it has been reported the presence of T. spiralis. The presence of genetic variability in isolates obtained from different infected animals, including horses, collected from different regions of Mexico has been suggested from studies where a high repeated sequence was amplified by PCR in the genome of T. spiralis called pPRA, has shown differences in the products obtained. Nowadays, conserved sequences, like the ribosomal gens (DNAr), are used like genetic markers and allow to determinate whit more precision the genetic variability in the isolates from the parasite. Therefore, the aim of this study was to determine the genetic variability in the SE-V sequence of the lsDNAr of T. spiralis isolates obtained from horses of different regions in Mexico. For it, 200 horse meat samples were collected from the slaughterhouses of San Vicente and Río Frío, both in the State of Mexico, Mexico, where there are horses from different regions of Mexico. The presence of the parasite by artificial digestion test and both by a simple PCR using the pPRA oligonucleotides and by a PCR multiplex assay that identifies both domestic and wild Trichinella species. In the study were included, 15 muscles samples and three blood’s horses as well as pig samples previously determined as positive for T. spiralis. By artificial digestion and PCR multiplex assay, was not detected the presence of the parasite in the horses samples of the study. However, by PCR assay using the primers pPRA, the expected products of 600 and 800 pb were amplified in 22 and 11% of the samples from San Vicente and Río Frío slaughterhouses, respectively, indicating the presence of T. spiralis in these samples. The positive samples included in the study were confirmed like positives. When positive samples were analyzed by PCR using a set of primers (oTsr 1 and oTsr 4) that amplify the SE-V of the lsDNAr of T. spiralis, the expected amplification product of 173 pb was obtained, confirming they were positive for T. spiralis. These positive samples were used to amplify the SE-V of the lsDNAr of T. spiralis but now using the oligonucleotides oTsr 3 and 4. The amplification products were purified and their polymorphism was determined by means of the non-radioactive SSCP assay. For the analysis, only consistent defined bands were considered, taking as reference the positive pig sample. A profile of 17 unique bands was observed, of these, 14 bands were polymorphic and 3 monomorphic, with a loci variability of 82%. The present study contributes to the knowledge of the genetic variability in the SE-V sequence of the lsDNAr of T. spiralis, in parasite populations present in horses with different geographic distribution. It is worth mention that polymorphism in SE-V sequence was also observed when horses and pig samples were compared. In order to define the changes the account for the polymorphism observed in the SE-V, we are currently sequencing these samples.; La Triquinelosis es una enfermedad parasitaira ocasionada por nemátodos del género Trichinella, que afecta a más de 150 especies de animales incluyendo al humano. Se transmite principalmente por el consumo de carne infectada de cerdo cruda o mal cocida; aunque, también el caballo puede transmitir la infección. El mecanismo de transmisión de esta parasitosis al caballo no se conoce. La triquinelosis es una zoonosis emergente o reemergente en varias regiones del mundo y está considerado un problema de salud pública por afectar a 11 millones de personas a nivel mundial. La clasificación taxonómica del parásito es complicada debido a que todas las especies presentan diferencias morfológicas menores, además, la existencia de variabilidad biológica y genética en los aislados de Trichinella obtenidos de distintas regiones geográficas y hospederos, dificulta su identificacción. Sin embargo, se han identificado a la fecha ocho especies y tres genotipos. En México, sólo se ha reportado la presencia de T. spiralis. La presencia de variabilidad genética en aislados de diferentes animales, incluyendo caballos, colectados de diferentes regiones de México ha sido sugerida a partir de estudios en los que se amplificó por PCR una secuencia altamente repetida presente en el genoma de T. spiralis, denominada pPRA. Actualmente, secuencias conservadas, como las de los genes ribosomales, se emplean como marcadores genéticos y permiten determinar con mayor exactitud la variabilidad genética en los aislados del parásito. Considerando lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar la variabilidad genética en la secuencia SE-V del ADN ribosomal de la subunidad grande (lsDNAr) de aislados de T. spiralis obtenidos de caballos de distintas regiones de México. Para ello, se obtuvieron 200 muestras de carne de caballo obtenidas de los mataderos San Vicente y Río Frío del Edo. de México, México, a donde llegan caballos de diferentes regiones del país. La presencia del parásito se analizó por el método de digestión artificial y por PCR simple usando los iniciadores pPRA, así como por un ensayo de PCR múltiplex, que permite la identificación tanto de la presencia del parásito como de la especie de que se trata. En el estudio se incluyeron 15 muestras de músculo y 3 de sangre de caballos, previamente determinadas como positivas para T. spiralis, además de dos aislados de cerdo. Tanto por el método digestión artificial como por el PCR múltiplex, no se detectó la presencia del parásito en las muestras de caballo colectadas en este estudio. Sin embargo, al analizar el material genético por PCR empleando los iniciadores pPRA se amplificaron los productos esperados de 600 y 800 pb en 22 y 11% de las muestras de los mataderos San Vicente y Río Frío, respectivamente, indicando la presencia de T. spiralis. Las muestras positivas incluidas en el trabajo, se confirmaron como positivas. Las muestras positivas por PCR con los oligos pPRA se analizaron con los iniciadores oTsr1 y oTsr4 que amplifican el SE-V del lsDNAr de T. spiralis, obteniéndose el producto de amplificación específico de 173 pb. Con otro juego de iniciadores (oTsr 3 y 4) se procedió a amplificar una región más amplia del SE-V del lsADNr del parásito, los productos obtenidos se purificaron y se emplearon para analizar el polimorfismo de la secuencia mediante el ensayo de SSCP no radiactivo. Para el análisis del polimorfismo sólo se consideraron las bandas claramente definidas y consistentes tomando como referencia el control porcino positivo. De esta forma, se observó un perfil de 17 bandas únicas, 14 de éstas fueron polimórficas y 3 monomórficas, con una variabilidad de loci del 82%. El presente trabajo aporta evidencias de la variabilidad genética en la secuencia del SE-V del lsADNr de T. spiralis, en poblaciones del parásito presentes en caballos con diferente distribución geográfica. De manera interesante, en este estudio también se observó polimorfismo en la secuencia SE-V de aislados del parásito provenientes de diferente hospedero (cerdo). Con la finalidad de determinar los cambios que se presentan en la secuencia del SE-V de las muestras que mostraron polimorfismo por SSCP, éstas se mandaron secuenciar.