Participación de la NADPH oxidasa en la activación del factor de transcripción STAT3 vía SRC-EGFR en cultivo primario de hepatocitos tratados con cadmio - Martínez Flores, Karina (Universidad Autónoma Metropolitana, 2013)
El cadmio (Cd) es un metal no esencial que se encuentra usualmente en la naturaleza como mineral en combinación con otros elementos en forma de óxido de cadmio (CdO), sulfato de cadmio (CdSO4) y cloruro de cadmio (CdCl2). Además se ha catalogado dentro de las 20 substancias más tóxicas de las cuales se ha incrementado su distribución en el medio ambiente por ser ampliamente utilizado en la manufactura de pilas, fertilizantes, cerámicas y plásticos, es de esta manera que el ser humano está expuesto a este metal y como consecuencia afecta varios órganos y tejidos, incluyendo el riñón, el pulmón, el páncreas y la próstata, sin embargo su órgano blanco es el hígado, donde basicame se acumula y se sintetiza una proteína de bajo peso molecular (6 kDa) metalotioneína (MT) que contiene grupos sulfhídrilos a los que el Cd se une como un mecanismo de defensa. A nivel celular existen evidencias que el Cd induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) en parte vía NADPH oxidasa. Se ha reportado a las ERO como mediadoras en vías de señalización en respuesta al Cd, llevando a la activación del factor de transcripción Stat-3, cuyo mecanismo de señalización se ha relacionado con MAPK y la transactivación mediada por la cinasa Src y el receptor de crecimiento epidermal (EGFR), al ser sensibles a ERO. Sin embargo a pesar de que el organismo trata de inducir una respuesta de defensa, se ha reportado que el Cd es capaz de llevar a las células a apoptosis. Es por ello el interés de estudiar el mecanismo de respuesta del hepatocito ante el Cd implicando la activación del factor de transcripción Stat-3 abordando la participación de la NADPH oxidasa y Src-EGFR así como su relación con la producción de MT-II y la apoptosis. Los hepatocitos fueron tratados con diferentes tiempos y concentraciones de Cd para evaluar la viabilidad celular mediante el ensayo de violeta cristal así como activación de Src, STAT3 , ERK1/2, MT-II, p53 y Bax por Western blot. La participación de las ERO en la activación del factor de transcripción Stat-3 y de la cinasa Src se evaluó pre tratando los hepatocitos con un antioxidante Catalasa pegilada (pCAT) por 30 min. Para evaluar la generación de ERO se utilizó el método fluorométrico con DCFH-DA y se realizó un barrido de tiempo (0, 2, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60 y 90 min), además para determinar la fuente de ERO los hepatocitos se pre trataron con el inhibidor de NADPH oxidasa (AEBSF) seguidos de 5 M de CdCl2 utilizando los tiempos del barrido. La actividad de la NADPH oxidasa se obtuvo midiendo el consumo de la NADPH inhibido por DPI empleando los mismos tiempos de incubación de la generación de ERO. El papel de NADPH oxidasa, Src y el EGFR en la fosforilación de Stat3, transactivación del EGFR, activación de ERK1/2 y producción de MT-II se evaluó pre tratando con los inhibidores: AEBSF, SU6656 para Src y AG1478 para el EGFR. La apoptosis se midió con la tinción del kit de Annexin-V-fluos por citometría de flujo. Los resultados demuestran un incremento significativo en la activación del factor a nivel de tirosina a partir de los 5 min e incrementándose con respecto al tiempo de incubación con el Cd. Por otra parte la fosforilación a nivel de serina presentó un incremento a partir de la hora. Con el antioxidante (pCAT) se encontró disminuida la activación en ambos sitos de fosforilación de Stat-3 así como la activación de Src. En la generación de ERO por Cd se observó una máxima producción de ERO a los 2.5 min declinando a los 5 min sin dejar ser significativa y por lo tanto sin llegar a niveles del control. La NADPH oxidasa participó en la formación de ERO, porque al pre tratar con su inhibidor (AEBSF) las ERO se abatieron de manera significativa con respecto a los hepatocitos tratados con sólo Cd. La actividad de la NADPH oxidasa mostró un comportamiento semejante al de la formación de ERO porque a los 2.5 min se encontró la máxima actividad de esta oxidasa. Al realizar las inmunoprecipitaciones de Src-EGFR, Stat3-Src y EGFR-Stat3 encontramos una interacción directa entre las proteínas estudiadas. En cuanto a la expresión de MT-II como proteína de respuesta final, esta comenzó a ser significativa a partir de las 2 h encontrando una máxima expresión de 60 veces más que el control a las 4 h. También se encontró que al pre-tratar con los inhibidores de NADPH oxidasa, Src y EGFR la expresión de la MT se disminuyen de manera significativa con respecto a los hepatocitos tratados con Cd. Finalmente a pesar de que el hepatocito trata de responder ante el Cd, lo lleva a apoptosis activando a p53 y Bax a las 12 h de tratamiento. Estos resultados sugieren que el Cd activa al factor de transcripción Stat3 a través de la participación de las ERO generadas por la NADPH oxidasa llevando a la fosforilación de Src, transactivación del EGFR y fosforilación de ERK1/2, dando como respuesta celular la expresión de la MT-II, pero finalmente los hepatocitos mueren por apoptosis implicando a p53 y Bax en el proceso.; Cadmium (Cd) is a metal which is non-essential in nature and usually in combination with other mineral elements in the form of cadmium oxide (CdO), cadmium sulphate (CdSO4) and cadmium chloride (CdCl2). It has further been listed in the most toxic substances 20 which has an increased distribution in the environment to be widely used in the manufacture of batteries, fertilizers, ceramics and plastics, is in this manner that the human being is exposed to This metal and consequently affects various organs and tissues, including the kidney, lung, pancreas and prostate, but its target organ is the liver, where it is accumulates and synthesize a low molecular weight protein (6 kDa) metallothionein (MT) containing the sulfhydryl groups that Cd binds as a defense mechanism. At the cellular level there is evidence that induces the production of reactive oxygen species (ROS) in part via NADPH oxidase. It has been reported as a ROS signaling pathways mediating defense response to Cd, leading to activation of the transcription factor Stat-3, the signaling mechanism is related MAPK mediated transactivation and Src kinase receptor epidermal growth (EGFR), to be sensitive to ROS. But even though the body tries to induce a defense response, it has been reported that Cd can cause cells to apoptosis. It is therefore of interest to study the mechanism of response of hepatocyte against Cd involving the activation of the transcription factor Stat3 addressing involving NADPH oxidase and Src-EGFR and its relationship with the production of MT-II and apoptosis . Hepatocytes were treated with different concentrations of Cd times and assessing cell viability using the crystal violet assay as activation of Src, Stat3, ERK1/2, MT-II, p53 and Bax by Western blot. The involvement of ROS in the activation of the transcription factor Stat-3 and the Src kinase was assessed pre treating hepatocytes with an antioxidant catalase pegylated (pCAT) for 30 min. To evaluate the generation of ROS fluorometric method was used with DCFH-DA and performed a sweep time (0, 2, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60 and 90 min), and to determine the source ROS pre hepatocytes are treated with the inhibitor of NADPH oxidase (AEBSF) followed by 5 M CdCl2  using scanning times. The NADPH oxidase activity was obtained by measuring the NADPH consumption DPI inhibited by using the same incubation times of the generation of ROS. The role of NADPH oxidase in Src and EGFR phosphorylation of Stat-3, EGFR transactivation, activation of ERK1/2 and MT-I production was assessed pre treated with inhibitors: AEBSF, SU6656 for Src and AG1478 for EGFR. Apoptosis was measured by staining kit Annexin-V-Fluos by flow cytometry. The results demonstrate a significant increase in activation of the tyrosine level factor from the 5 min and increasing with respect to time of incubation with the Cd Moreover phosphorylation at serine showed an increase from the time.With the antioxidant (pCAT) activation was decreased in both sites of phosphorylation of Stat-3 activation and Src. In the generation of ROS by Cd was observed maximum ROS production declining by 2.5 min at 5 min while being significant and therefore did not reach levels of control. The NADPH oxidase involved in the formation of ROS, because the pre treat with its inhibitor (AEBSF) ROS were brought down significantly compared to hepatocytes treated with Cd only behavior of NADPH oxidase activity showed a similar behavior the formation of ROS for the 2.5 min peak was found for this oxidase. When performing immunoprecipitations of Src-EGFR, Stat-3-Src and EGFR-Stat-3 found a direct interaction between each pair of proteins studied. As for the expression of MT-II protein as final response, it began to be significantly after 2 h finding the maximum expression 60 times more than the control at 4 h. We also found that by pretreating with NADPH oxidase inhibitors, Src EGFR expression and the MT are reduced significantly with respect to hepatocytes treated with Cd Finally Cd that the hepatocyte is accountable to the Cd, leads to apoptosis activating p53 and Bax at 12 h of treatment. These results suggest that the active Cd transcription factor Stat-3 through the involvement of ROS generated by NADPH oxidase leading to the phosphorylation of Src EGFR transactivation and phosphorylation of ERK1/2, leading to the expression cell response MT-II, but eventually die due to apoptosis of hepatocytes involving p53 and Bax in the process.