Estudio termodinámico de la asociación de la cistatina C humana con la quimopapaína - Tovar Anaya, David Octavio (Universidad Autónoma Metropolitana, 2020)
En la presente tesis se realizó la caracterización termodinámica de la unión de la proteasa cisteínica quimopapaína (carboximetilada en su -SH catalítico) a la cistatina C humana (CCH), la cual es un inhibidor reversible natural de las proteasas cisteínicas. La afinidad de la CCH por proteasas cisteínicas tipo papaína incluidas las catepsinas, oscila de acuerdo con las constantes de unión (KU) entre 106 y 1014 M-1. La calorimetría de titulación isotérmica (CTI) es una de las técnicas más útiles para caracterizar la termodinámica de interacción intermolecular, permitiendo separar la energía libre de unión (ΔGU) en sus componentes entálpico (∆HU) y entrópico (T∆SU). Esta información, junto con los cambios estructurales que se producen durante la asociación, podría permitirnos comprender mejor las bases moleculares que llevan a esa variación considerable en la afinidad. La CTI requiere concentraciones de proteína de al menos 10-100 μM para obtener datos confiables; sin embargo, es conocido que la CCH es propensa a formar dímeros y oligómeros de orden superior a través de un mecanismo de intercambio de dominios a partir de concentraciones de 16.0 μM, perdiendo su capacidad inhibitoria. Nilsson y col., 2004, mostraron que al introducir un enlace disulfuro en la CCH silvestre mediante las mutaciones puntuales L47C y G69C, se inhibe el reacomodo de los dominios manteniendo el estado monomérico de la proteína. Esta forma de cistatina C estabilizada (CCE), se obtuvo por mutagénesis dirigida del vector que contiene el gen de la CCH madura incluyendo el codón de inicio. Ambas proteínas, CCH y CCE, se purificaron del sobrenadante de lisis en tres etapas cromatográficas, mientras que la quimopapaína se inactivó por carboximetilación de su Cys catalítica, y purificó por cromatografía de intercambio catiónico. Se realizó un estudio comparativo de la termodinámica de unión de la proteasa cmQ con la cistatina C silvestre y su mutante estabilizada, comparando además las propiedades estructurales, estabilidad térmica y oligomerización de ambos inhibidores. Se efectuó el estudio calorimétrico de la formación de los complejos cmQ–CCH y cmQ–CCE en amortiguador de fosfatos 10 mM, pH 7.0 y fuerza iónica de 0.1 M ajustada con NaCl. Por CTI se determinaron los parámetros termodinámicos asociados a la formación del complejo: KU, ∆HU, T∆SU y ΔGU, así como el número de sitios de unión (n), al ajustar los datos al modelo de sitios de unión idénticos e independientes. El valor del ΔCp se obtuvo de la dependencia térmica de la entalpía, al realizar titulaciones isotérmicas a distintas temperaturas. Ambos sistemas mostraron afinidades moderadas con una KU del orden de 106 M-1, aunque ligeramente mayor para el complejo cmQ–CCE, y una entalpía de unión exotérmica que se hace más negativa a temperaturas mayores dado que el ΔCp para ambos sistemas es negativo. Se construyó un modelo atómico para cada complejo quimopapaína–Inhibidor, por el acoplamiento rígido de las estructuras 3D individuales. Para el caso particular de CCH su estructura 3D se modeló de la estructura 3D de la CCE al cambiar los residuos C47 y C69 por L y G respectivamente. Tanto las estructuras de los inhibidores como de los complejos se sometieron a una simulación de dinámica molecular durante 200 ns en solvente explícito a 350 K y 450 K. La CCE mostró un aumento en la estabilidad estructural en comparación con la CCH, al tardar más del doble de tiempo en perder su conformación de hélice α a 450 K esto concuerda con los resultados de CDB en los que CCE muestra una mayor estabilidad térmica que CCH, con un aumento en la Tm de 11 °C. El análisis de la interfaz de los complejos identificó a un radio de corte de 3.0 Å que estos se mantienen unidos principalmente por la formación de puentes de hidrógeno e interacciones iónicas. Los valores de ∆Cp determinados a través de modelos semiempíricos de área superficial accesible al solvente son menos negativos que los determinados experimentalmente, lo que sugiere la posible fijación de moléculas de agua en la interfaz predominantemente de estos complejos. Asimismo, los valores de ∆HU calculados con los modelos de área superficial son bastante más exotérmicos que los experimentales, lo que nos hace suponer que los coeficientes de proporcionalidad ∆hp y ∆hap no son del todo adecuados para este tipo de complejos.