Expresión de Bcl-2 ante el reto oxidativo - Luna López, Armando (Universidad Autónoma Metropolitana, 2006)
Aging is a complex and inevitable biological phenomenon that is characterized by the lose of several biochemical, structural and physiological functions in the organisms throughout their lifespan. Harman´s aging theory suggests that this process is the result of the overall accumulated damage on cellular macromolecules generated by free radicals. Now a days, it is thought that aging is induced by a multifactorial process in which oxygen reactive species play an important role. Bcl-2 is a survival protein due to its antiapoptotic task, as well as its role in cell cycle regulation trough p130 and p27. Bcl-2 also increases DNA repair systems. However, one if Bcl-2 most important functions is its participation in antioxidant response, its over-expression has shown to increase antioxidant enzymes activity and modify cellular oxidative state. For these reasons is relevant to establish the relation between Bcl-2 and other biological phenomenon associated with oxidative stress that can lead to different cellular responses like apoptosis, cancer or Replicative senescence. In this work the effect of oxidative stress on Bcl-2 expression was determined as well as the cellular survival index (Bcl-2/Bax ratio). All the experiments were done in the L-929 mice lung fibroblasts cell line. Cells were subjected to 50, 100,150 y 200μM H2O2 for 9h. Bcl-2 massager RNA (RNAm) was determined by semiquantitative RT-PCR Interestingly, a statistical difference in the increment of Bcl-2 RNAm was only found in 50μM H2O2 treatment and not in the other treatments. Viability and functionality parameters were also quantified using trypan blue and MTT assays respectively. The results indicated a statistical decrease in both parameters only in 200μM treatment. Our results show an increase in Bcl-2 expression al low oxidative concentrations. One possible explanation is that Bcl-2 regulation might be related to DNA oxidative damage. When the expression of the anti-apoptotic protein Bax was performed in the same treatment conditions, a low increase was found. The rate Bcl-2/Bax was lower that 1.0 in the treatments with 100,150 y 200 µM, suggesting that the might not be able to handle high oxidative stress. This oxidative stress might induce damages that modify cellular response and provoke cellular death.; El envejecimiento es un fenómeno biológico complejo e inevitable que se caracteriza por la pérdida o decaimiento de varias funciones bioquímicas estructurales y fisiológicas de los organismos a lo largo de su vida. La teoría del envejecimiento de Harman sugiere que este proceso se da por la acumulación de daños generados por los radicales sobre las macromoléculas celulares. Actualmente, el consenso general en cuanto a los mecanismos que inducen el envejecimiento, es que se lleva a cabo por procesos multifactoriales y que las especies reactivas de oxigeno son un factor que contribuye en alto grado. La proteína Bcl-2 tiene una función de supervivencia celular tanto por su papel antiapoptótico como por su regulación del ciclo celular vía p130 y p27, así como el aumento en la actividad de los sistemas reparadores de daño al ADN. Sin embargo, una de sus funciones mas importantes es su participación en la respuesta antioxidante, en donde al sobre-expresarse se ve aumentada la actividad de las enzimas antioxidantes y con ello se modifica el balance en el estado redox celular. Es por eso relevante establecer la relación de Bcl-2 con otros fenómenos biológicos que también están asociados con un estado de estrés oxidativo, y que conllevan a diferentes respuestas celulares, como lo son la apoptosis, el cáncer o la senescencia replicativa. El objetivo de este trabajo fue el determinar el efecto de la inducción de un estado de estrés oxidativo mediante diversas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre la expresión de la proteína Bcl-2, así como la obtención del índice de supervivencia celular de acuerdo a la expresión Bcl-2/Bax en la línea celular de fibroblastos de pulmón de ratón L-929. Para ello se cuantificó la expresión del ARN mensajero (ARNm) que codifica para Bcl-2 por medio RT-PCR semicuantitativo en fibroblastos de pulmón de ratón de la línea L-929 sometidas a concentraciones de 50, 100,150 y 200μM de H2O2 durante 9 horas. De manera interesante se encontró un incremento estadísticamente significativo en la expresión del ARNm de Bcl-2 con el tratamiento de 50μM de H2O2, no así en los demás tratamientos. Así mismo se determinaron los parámetros de viabilidad y funcionalidad celular por medio de las técnicas de exclusión de azul tripano y MTT respectivamente, encontrándose una disminución significativa en ambos parámetros únicamente en el tratamiento con 200μM de H2O2. Estos resultados muestran que el aumento en la expresión de Bcl-2 se da a bajas concentraciones de H2O2. Una posible explicación es que la regulación de la expresión de Bcl-2 podría estar determinada por el daño oxidativo al ADN. Al evaluarse los niveles de expresión de la proteína proapoptótica Bax se encontró un ligero aumento bajo las mismas condiciones de tratamiento, y el índice de expresión Bcl-2/Bax obtuvo un valor menor a 1.0 en los tratamientos de 100, 150 y 200 µM. Los resultados sugieren que las células no pueden manejar el reto oxidativo, que posiblemente genere daños que modifiquen la respuesta celular, y que por tanto, la llevan a la muerte.