Análisis proteómico de las vías de señalización mediadas por la subunidad Gα Pga1 de una proteína G heterotrimérica de Penicillium chrysogenum - Carrasco Navarro, Ulises (Universidad Autónoma Metropolitana, 2017)
The heterotrimeric Gα protein Pga1-mediated signaling pathway regulates the entire developmental program in Penicillium chrysogenum, from spore germination to the formation of conidia. In addition it participates in the regulation of penicillin biosynthesis. We aimed to advance the understanding of this key signaling pathway using a proteomics approach, a powerful tool to identify effectors participating in signal transduction pathways. P. chrysogenum mutants with different levels of activity of the Pga1-mediated signaling pathway were used to perform comparative proteomic analyses by 2DDIGE and LC–MS/MS. Thirty proteins were identified which showed differences in abundance dependent on Pga1 activity level. By modifying the intracellular levels of cAMP we could establish cAMP-dependent and cAMP-independent pathways in Pga1-mediated signaling. Pga1 was shown to regulate abundance of enzymes in primary metabolic pathways involved in ATP, NADPH and cysteine biosynthesis, compounds that are needed for high levels of penicillin production. An in vivo phosphorylated protein containing a pleckstrin homology domain was identified; this protein is a candidate for signal transduction activity. Proteins with possible roles in purine metabolism, protein folding, stress response and morphogenesis were also identified whose abundance was regulated by Pga1 signaling. For phosphoproteomic analyses, two different methodologies were used: 2D-DIGE with phosphoprotein-enriched extracts followed by identification of individual puntos by LC-MS/MS, and a "Label-Free" phosphoproteomics approach with phosphopeptide-enriched extracts (using TiO2 affinity chromatography) submitted to LC-MS/MS. The 2D-DIGE analysis showed changes in abundance of phosphorylated proteins when comparing the strains, but little information on differential phosphorylation. 383 phosphorylated proteins were identified from 8343 total spectra, the Label-Free phosphoproteomic analysis showed changes in the phosphorylation patterns of proteins between strains, which allowed to identify new effectors of the Pga1 signaling pathway. Fifteen probable transcription factors and chromatin remodeling proteins were identified, one of these proteins was 8 Pc16g10400 (protein with a Bromo Adjacent Homology domain and a PHD zinc finger domain), with two phosphorylation sites at S-738 and S-742, of which the S742 site is present only in the Δpga1 strain.; La vía de señalización mediada por la subunidad Gα Pga1 de una proteína G heterotrimérica regula el desarrollo en Penicillium chrysogenum, desde la germinación de esporas hasta la formación de conidios. Además participa en la regulación de la biosíntesis de penicilina. Nuestro objetivo fue avanzar en la comprensión de esta vía clave de señalización utilizando un enfoque proteómico, que resulta en una poderosa herramienta para identificar nuevos efectores que participan en las vías de transducción de señales. Para realizar los análisis proteómicos comparativos mediante 2D-DIGE y LCMS/MS se utilizaron mutantes de P. chrysogenum con diferentes niveles de actividad de la vía de señalización mediada por Gα Pga1. Se identificaron treinta proteínas que mostraron cambios significativos en la abundancia de una forma dependiente de la actividad de Gα Pga1. Mediante la modificación de los niveles intracelulares de AMPc logramos establecer vías AMPc-dependiente y AMPcindependiente de Pga1. Se demostró que Gα Pga1 regula la abundancia de enzimas de las vías metabólicas primarias implicadas en la biosíntesis de ATP, NADPH y cisteína, compuestos que son necesarios para la biosíntesis de penicilina. Se identificó una proteína fosforilada in vivo que contiene un dominio Pleckstrin (PH); Esta proteína es candidata para formar parte de vías de transducción de señales. También se identificaron proteínas con posibles funciones en el metabolismo de purinas, plegamiento de proteínas, respuesta al estrés y morfogénesis, cuya abundancia fue regulada por la señalización Gα Pga1. Para los análisis fosfoproteómicos, se utilizaron dos metodologías diferentes: 2DDIGE con extractos enriquecidos de fosfoproteínas seguido de la identificación de los spots (puntos) individuales por LC-MS/MS, y un enfoque fosfoproteómico mediante la metodología "Label free" con extractos enriquecidos de fosfopéptidos (usando cromatografía de afinidad con TiO2) y LC-MS/MS. El análisis 2D-DIGE mostró cambios en la abundancia de proteínas fosforiladas, sin embrago se obtuvo poca información sobre la fosforilación diferencial. En el análisis de "Label free" se identificaron 383 proteínas fosforiladas a partir de 8343 espectros totales, además se logró identificar cambios en los patrones de fosforilación de proteínas entre las 6 condiciones, lo que permitió identificar nuevos efectores de la vía de señalización mediada por Gα Pga1. Se identificaron probables factores de transcripción y proteínas fosforiladas de remodelación de la cromatina, una de estas proteínas fue Pc16g10400 (proteína con un dominio Bromo y tres dominios PHD), con dos sitios de fosforilación en S-738 y S-742, sin embargo la fosforilación en S-742 está presente sólo en la cepa Δpga1.