Uso integral del almidón de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en la producción de CGTasa para la síntesis de ciclodextrinas Público Deposited
Durante la degradación del almidón, que es catalizada por la enzima bacteriana del género Bacillus, ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa), se obtienen compuestos denominados ciclodextrinas (CDs) que son ampliamente utilizados en la industria alimentaría por su capacidad para formar complejos de inclusión. Esta investigación propone el uso integral de la planta de amaranto a partir del grano, mediante la extracción y aplicación del almidón de amaranto (AA) como una fuente alternativa para la obtención de CGTasa y CDs, así como también para la obtención de polifenoles no extraíbles (PNE) a partir de la fibra del rastrojo de amaranto, en los cuales se evaluó la formación de complejos de inclusión β-CD/polifenol. Al realizar la caracterización una fermentación sumergida por Bacillus megaterium probando AA como fuente de carbono, se obtuvieron los siguientes parámetros cinéticos: µ=0.094±2x10-3 (h-1 ), YX/S=11.47 (gXg-1S), YE/X=9775 (Ug-1X) YE/S=44602 (Ug-1S). La máxima actividad de ciclación específica (106.62±8.33 Umg-1 ) se observó a las 36 h. La CGTasa obtenida después de dos etapas de purificación presentó un rendimiento de 10.25% (p/v) y un aumento en la actividad específica hasta 3946 Umg-1 , con respecto al extracto crudo, presentó un peso molecular aparente de 66KDa mediante electroforesis SDS-PAGE, un pH óptimo de 8 y una temperatura óptima de 50 °C, así como una Km de 7.6 mgmL-1 y una Vmáx de 1.53 mg mL-1h -1 al utilizar AA como sustrato, observándose una afinidad 50% más alta en comparación con el almidón de maíz. Al utilizar la CGTasa parcialmente purificada en la síntesis de CDs, se obtuvo una producción de α-CD, β-CD y γ-CD, las cuales se identificaron por espectrofotometría de masa con una m/z de 983.6412, 1157.35 y 1301.5763 respectivamente. La β-CD fue la que estuvo en mayor proporción y al ser purificada mediante un proceso de cristalización presentó un rendimiento del 15.2%. La productividad de β-CD se aumentó hasta un 50% al realizar una pre-gelatinización a 50°C con el 3% (p/v) de AA en presencia de etanol (0.01% v/v). Mediante una hidrólisis ácida realizada en un reactor tipo Parr a 120°C durante 150 minutos con 5% de H2SO4, se obtuvieron PNE (93.11 ± 5.18 mg eq AG/g) de la fibra de la planta de amaranto, los cuales al evaluar su actividad antioxidante, presentaron un IC50 sobre el DPPH• de 0.89 ± 0.05 mg eq AG/g y un IC50 sobre el ABTS• de 0.54 ± 0.017 mg eq AG/g. Los PNE fueron identificados por ESI-MS como ácido 4- hidroxibenzoico, ácido ferúlico, ácido gálico, rutinoside y el kaempferol; m/z = 132.99, 193.02, 172.99, 327.21 y 297.14 respectivamente. Los PNE se incluyeron en la β-CD de AA mediante una mezcla física. El complejo de inclusión β-CD-PNE fue identificado por el efecto hipocrómico presentado en los patrones de absorbencia. Al evaluar la actividad antioxidante del complejo de inclusión β-CD-PNE se observó que se mantiene durante 7 semanas. Esta investigación concluye que el almidón de amaranto tiene un gran potencial para ser utilizado en los procesos de producción de CGTasa y de β-CD, permitiendo sustituir a los almidones convencionales de maíz utilizados para este fin, así mismo, el amaranto es una planta que puede ser aprovechada para la obtención de antioxidantes naturales, los cuales a su vez pueden formar inclusiones con la β-CD para mantener su actividad antioxidante.
During the degradation of starch, which is catalyzed by the bacterial enzyme, the gender Bacillus cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase), are obtained cyclodextrins compounds called (CDs) that are widely used in the food industry for its ability to form inclusion complexes. These research proposes the integrated use of the amaranth plant, from the grain by extraction and application of amaranth starch (AS) as an alternative for obtaining CGTase and CDs source, as well as for obtaining the nonremovable polyphenols (NP) from fiber stubble amaranth, in which the formation of inclusion complexes β-CD / polyphenol was evaluated. Performing the characterization of a submerged fermentation by testing AS Bacillus megaterium as carbon source, the following kinetic parameters were obtained: μ=0.094 ± 2x10-3 (h-1 ), YX/S = 11.47 (GxG-1S), YE/X = 9775 (Ug-1X) y E/S = 44602 (Ug-1S). The maximum specific activity cyclization (106.62 ± 8.33 Umg-1 ) was observed at 36 h. CGTase obtained after two purification steps showed a yield of 10.25% (w/v) and an increase in the specific activity to 3946 Umg-1 , with respect to the row extract, showed an apparent molecular weight of 66kDa by electrophoresis SDS-PAGE, an optimum pH of 8 and a temperature optimum of 50 °C, and a Km of 7.6 mgml-1 and a Vmax of 1.53 mg mL-1 h -1 using AS as substrate, showing a higher affinity 50% in compared to corn starch. By using the partially purified CGTase in the synthesis of CDs, a production of α-CD, β-CD and γ-CD, which were identified by mass spectrometry with a m/z 983.6412, 1157.35 and 1301.5763 respectively was obtained. The β-CD was the one that was greater extent and to be purified by a crystallization process provided 15.2% yield. Productivity β-CD was increased to 50% to make a pregelatinization at 50 °C with 3% (w/v) in the presence of AS ethanol (0.01% v/v). By acid hydrolysis carried out in a Parr type reactor at 120 °C for 150 minutes with 5% H2SO4, were obtained a NP of the plant fiber amaranth (93.11 ± 5.18 mg eq AG/g), to evaluate their antioxidant activity, showed an IC50 of the DPPH • ± 0.05 mg 0.89 eq AG/g and an IC50 on ABTS •±0.017 mg 0.54 eq AG/g. The NP were identified by ESIMS as 4-hydroxybenzoic acid, ferulic acid, gallic acid, kaempferol rutinoside and; m/z = 132.99, 193.02, 172.99, 327.21 and 297.14 respectively. The NP included in the β-CD physical mixture through AS. The complex of β-CD-NP inclusion was identified by the hypochromic effect patterns presented in absorbency. Assessing antioxidant activity of inclusion complex β-CD-NP was observed that remains for 7 weeks. This research concluded that starch amaranth has great potential for use in production processes CGTase and β-CD, allowing replace conventional corn starches used for this purpose, furtheremore the amaranth plant it can be exploited for obtaining natural antioxidants, which can form inclusions with β-CD to maintain its antioxidant activity.
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