Identificación de residuos de carbohidratos de proteínas asociadas a balsas lipídicas (rafts) de espermatozoides de cerdo - López Salguero, José Benito (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
Mammalian sperm are motile after ejaculation, but cannot fertilize the egg. This ability is acquired during passage through the female reproductive tract and it is called sperm capacitation. In this process the activation of both, a bicarbonate (HCO₃- ) dependent adenylate cyclase and a protein kinase A (PKA) allow tyrosine phosphorylation of a group of proteins, and this is associated with changes in sperm motility and acrosome reaction. The plasma membrane is modified during the capacitation, especially lipid rafts, small platforms within the plasma membrane, composed of specific proteins, glycosphingolipids, gangliosides and cholesterol in the exoplasmic face, connected to phospholipids and cholesterol on the cytoplasmic face. The signaling proteins of the lipid rafts are specific of the cell type and physiological state, and include non-receptor and receptor proteins with tyrosine kinase activity, G proteins, inositol phospholipids, glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins, nitric oxide synthase and others. The aim of this work was to identify carbohydrate residues of proteins associated with lipid rafts of fresh and capacitated boar spermatozoa. Seven semen samples of healthy boars were analyzed. Capacitation was induced in vitro by incubating in TALP-Hepes medium during 4 hours at 39 ˚C. Lipid rafts were obtained by ultracentrifugation in discontinuous sucrose gradient, specifically in the 5-35% interphase, in both conditions. Electrophoresis was performed with 12.5 % polyacrylamide gels, with 20 g of protein per lane. The fraction corresponding to lipid rafts of fresh sperm showed 16 bands with Mr of 11 to 134 kDa and in capacitated sperm, from 11 to 141 kDa. Carbohydrate residues identification was performed by Western blot, using DSA and SNA lectins, specific for N-acetylglucosamine and sialic acid, respectively. DSA lectin joined to 8 bands of proteins in rafts of fresh sperm and 11 of capacitated sperm. SNA joined 4 bands in fresh sperm and 7 in the capacitated. Our results show that the proteins associated with lipid rafts of capacitated spermatozoa are glycosylated with residues of Nacetylglucosamine and sialic acid, and the number of glycosylated proteins associated with lipid rafts increases after capacitation.; Los espermatozoides de mamífero son móviles después de ser eyaculados, pero no pueden fertilizar al óvulo. Esta habilidad la adquieren durante su paso por el tracto reproductivo de la hembra y se le llama capacitación espermática, en la cual la activación de una adenilciclasa dependiente de bicarbonato (HCO₃- ) y de la proteína cinasa A (PKA) permiten la fosforilación de tirosinas de un grupo de proteínas, y esto se asocia con cambios en la movilidad espermática y la capacidad de respuesta del acrosoma. La membrana plasmática se modifica durante la capacitación, en especial las balsas lipídicas (rafts), compuestas de proteínas específicas, glicoesfingolípidos, gangliósidos y colesterol en la cara exoplásmica, conectada a fosfolípidos y colesterol en la cara citoplásmica de la membrana. Las proteínas de señalización de los rafts son específicas del tipo de célula y de su estado e incluyen, proteínas receptoras y no receptoras con actividad de tirosina cinasa, proteínas G, fosfolípidos de inositol, proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI), óxido nítrico sintasa y otras. El objetivo de este trabajo fue Identificar residuos de carbohidratos de proteínas asociadas a los rafts de espermatozoides de cerdo frescos y capacitados. Se analizaron 7 muestras de semen de sementales sanos. Se indujo la capacitación in vitro incubando en medio TALP-Hepes 4 horas a 39˚C. Se obtuvo la fracción de rafts por ultracentrifugación en gradiente discontinuo de sacarosa, observándose una región opalescente en la interface del gradiente de 5-35% en ambas condiciones. Se realizaron electroforesis con geles de poliacrilamida al 12.5%, con 20 µg de proteína por carril. En la fracción correspondiente a las balsas lipídicas de espermatozoides frescos se observaron 16 bandas con Mr de 11 a 134 kDa y en los capacitados desde 11 hasta 141 kDa. La identificación de residuos de carbohidratos se realizó por Western Blot, usando las lectinas DSA y SNA, específicas para Nacetilglucosamina y ácido siálico respectivamente. DSA se unió a 8 bandas de proteínas de los rafts de espermatozoides frescos y a 11 de capacitados. SNA se unió a 4 bandas de espermatozoides frescos y a 7 de capacitados. Nuestros resultados muestran que las proteínas asociadas a balsas lipídicas de espermatozoides capacitados se encuentran glicosiladas con residuos de Nacetilglucosamina y de ácido siálico y se incrementa el número de proteínas glicosiladas asociadas a balsas lipídicas después de la capacitación.