Efecto de iones en la actividad de la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima empleada en la síntesis de oligosacáridos fucosilados - Torres Ochoa, Catalina (Universidad Autónoma Metropolitana, 2024)
Human milk is the fundamental food for the development and growth of newborns, which is composed of a great variety of nutritional and bioactive compounds, among which are the human milk oligosaccharides (HMOs). This complex family of carbohydrates contains the fucosylated oligosaccharides (FucOs) as the group of greatest interest, because they participate in numerous crucial physiological processes important for the health of infants. In the present work, the effect of different ions (Ca2+, Mg2+, Mn2+, and Cu2+) on the activity of α-L-fucosidase from Thermotoga maritima (FUC-Tm) was evaluated, with the aim of increasing the yield of FucOS synthesis through the transfucosylation reaction. In the first instance, the effect of the aforementioned ions on the hydrolytic activity of FUC-Tm was evaluated using CaCl2, MgCl2, and MnCl2 concentrations of between 0.25 and 1.5 M and CuSO4 concentrations of 1 and 10 mM. The concentrations evaluated had an increase in hydrolytic activity of 173% in the presence of CaCl2 at 1 M concentration, 138% with 1 M MgCl2, and only 53% with 0.75 M MnCl2. On the other hand, in the presence of Cu2+ the enzyme activity was inhibited using CuSO4 concentrations of 1 and 10 mM. Since the hydrolytic activity of the enzyme was higher when CaCl2 was used, it was decided to evaluate its effect on the synthesis of FucOS, using p-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside (pNPFuc) as donor substrate and lactose as acceptor substrate. A maximum yield of 55.24% was obtained with 0.5 M CaCl2 and water activity (aw) of 0.976, likewise, these conditions represented a FucOS production two times higher than that obtained in the absence of said ion, indicating that the presence of Ca2+, together with the decrease in aw favored transfucosylation. Subsequently, an in silico study on the interaction between Ca2+ and FUCTm was performed through a molecular dynamics (MD) simulation, both in the absence and presence of the ion. No changes were observed at the global level in the enzyme structure, according to the root mean square standard deviation (RMSD) and radius of gyration (Rg) values. However, the results of the root of the squared standard fluctuation (RMSF) revealed that Ca2+, can induce a change in the stability of the enzyme catalytic pocket by decreasing the fluctuation of residues that influence the active site cavity such as Asp190, increasing its accessibility for binding to fucose, which helps to explain the increase in enzyme activity when the ion is present. Finally, with the MD simulation of the enzyme-substrate complex, a difference in the stability of the complex between pNP-Fuc and FUC-Tm in the presence and absence of Ca2+ was observed, reflecting a lower binding energy, suggesting the formation of a more stable enzyme-substrate complex when calcium ion is present, agreeing with results obtained in vitro.; La leche humana es el alimento fundamental para el desarrollo y crecimiento de los recién nacidos, la cual está conformada por una gran variedad de compuestos nutricionales y bioactivos, entre los que se encuentran a los oligosacáridos de la leche humana (HMOs). Esta compleja familia de carbohidratos contiene a los oligosacáridos fucosilados (FucOS) como el grupo de mayor interés, debido a que participan en numerosos y cruciales procesos fisiológicos importantes para la salud de los lactantes. En el presente trabajo se evaluó el efecto de diferentes iones (Ca2+, Mg2+, Mn2+ y Cu2+) sobre la actividad de la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima (FUC-Tm), con el objetivo de aumentar el rendimiento de síntesis de FucOS a través de la reacción de transfucosilación. En primera instancia, se evaluó el efecto de los iones anteriormente citados en la actividad hidrolítica de FUC-Tm, utilizando concentraciones de CaCl2, MgCl2, y MnCl2 de entre 0.25 y 1.5 M y concentraciones de CuSO4 de 1 y 10 mM. Las concentraciones evaluadas tuvieron un incremento en la actividad hidrolítica del 173% en presencia de CaCl2 a una concentración de 1 M, del 138% con 1 M de MgCl2 y solo del 53% con 0.75 M de MnCl2. Por otro lado, en presencia de Cu2+ la actividad de la enzima fue inhibida empleando concentraciones de CuSO4 de 1 y 10 mM. Dado que la actividad hidrolítica de la enzima fue mayor cuando se empleó CaCl2, se decidió evaluar su efecto sobre la síntesis de FucOS, empleando como sustrato donador el compuesto p-nitrofenil-α-L-fucopiranósido (pNP-Fuc) y lactosa como sustrato aceptor. Se obtuvo un rendimiento máximo del 55.24% con 0.5 M de CaCl2 y actividad de agua (aw) de 0.976, asimismo, estas condiciones representaron una producción de FucOS dos veces mayor a lo obtenido en ausencia de dicho ion, indicando que la presencia de Ca2+, junto con la disminución de aw favorecieron la transfucosilación. Posteriormente, se realizó un estudio in silico sobre la interacción entre Ca2+ y FUC-Tm a través de una simulación de dinámica molecular (DM), tanto en ausencia como en presencia del ion. No se observaron cambios a nivel global en la estructura de la enzima, de acuerdo con los valores de la raíz de la desviación estándar cuadrática (RMSD) y el radio de giro (Rg). Sin embargo, los resultados de la raíz de la fluctuación estándar cuadrática (RMSF) revelaron que el Ca2+ , puede inducir un cambio en la estabilidad del bolsillo catalítico de la enzima, al disminuir la fluctuación de residuos que influyen en la cavidad del sitio activo como el Asp190 , aumentando su accesibilidad para la unión con la fucosa, lo que ayuda a explicar el incremento en la actividad de la enzima al estar presente el ion. Finalmente, con la simulación de DM del complejo enzima-sustrato, se observó una diferencia en la estabilidad del complejo entre pNP-Fuc y FUC-Tm en presencia y ausencia de Ca2+, reflejando una menor energía de unión, sugiriendo la formación de un complejo enzima-sustrato más estable al estar presente el ion calcio, concordando con resultados obtenidos de forma in vitro.