Efecto del ácido perfluorooctanoico sobre el flujo del Ca2+ intracelular durante la capacitación in vitro de espermatozoides de cerdo doméstico - Hernández Ojeda, Guadalupe (Universidad Autónoma Metropolitana, 2017)
Perfluorooctanoic acid is a bioacumulative antrhopogenic pollutant, resistant to environmental degradation, which has been used for many years on the industry. Several reports point the toxic effects of PFOA at different biological levels, including the diminish of fertility and sperm count, until homeostasis alteration of Ca2+i in neurons. In sperm cells, Ca2+i plays a vital role on the capacitation and the Acrosomal Reaction (AR), both process involved on sperm maturation and therefore on fertilization. The aim of this study was to determine the effect of PFOA on Ca2+i movilization during capacitation and AR on boar sperm. The theoretical PFOA LC50 was 950 µM; 478 µM and 190 µM were considered as LC50/2 y LC50/5, respectively. However when LC50 was tested it did not show to be lethal for half of the cell population exposed to PFOA. In respect to motility, the percentage of hyperactivated spermatozoa did not change although there was a diminish on the percentage and size of agglutination on a dose dependent manner being 60% at 950 µM. With CTC it was observed that, with PFOA at 950 µM, capacitation and spontaneous AR were kept at 85% and 19% respectivley. But, based on 5 patterns of sperm fluorescence obtained with Fluo-3 AM, which is a fluorescent calcium indicator, PFOA 950 µM decreased capacitation to 54% whereas increased AR to 49%. By flow cytometry three sperm populations were found: M1, M2 and M3; M2 was considered as non capacitated spermatozoa while M3 was considered as reacted and capacitated spermatozoa. Based on this, during capacitation in the presence of PFOA 950 µM on M3 there was a decrease on Fluo3-AM fluorescence, that is Ca2+i, from 28,636 to 20,116. Likewise when the AR was induced with 950 µM of PFOA, Fluo-3 AM fluorescence diminished from 29,131 to 12,743 while at the same time, there was a rise on Fluo-3 AM on M2 from 6,415 to 15,153. Although it was not possible to find the real LD50, with CTC it was observed that PFOA keeps the rate of capacitation and AR, however CTC indicates the Ca2+ on the 4 sperm membrane. When Fluo-3 AM was used, it gave more information and showed a decrease on capacitation because of a rise on reacted sepermatozoa when PFOA was present. This coud be explained by the exit of Ca2+ from the celular storages and acrosome that promoted and accelarated the AR, or by an influx of Ca2+ through typeL Ca2+ channels activated by changes on membrane potential. Also the production reactive oxigen species (ROS) could promote capacitation and accelarate AR. Likewise, with PFOA it was observed a decrease on aglutination that indicates that capacitation is happening, which reinforce that PFOA was promoting sperm capacitation. In contrast to somatic cells, where a non regulated increase of Ca2+i by PFOA can be lethal, on spermatozoa the PFOA stimulated capacitation and AR, although the rise on spontaneous or induced AR, when PFOA was present during capacitaction indicates that this perfluorinated compound could compromise the capacity of the sperm to fertilize. More studies are necesary for a better undertstanding of PFOA mechanisms on Ca2+i regualtion during capacitation and AR on the sperm.; El ácido perfluorooctanoico (PFOA) es un compuesto antropogénico contaminante, no degradable y bioacumulable que se ha utilizado por varios años en diferentes industrias. Existen reportes que indican los diversos efectos tóxicos de los perfluoraduos, incluido el PFOA, en los sistemas biológicos, que incluyen desde disminución de la fertilidad y conteo espermático hasta efectos en la homeostasis del Ca2+i en neuronas. En los espermatozoides, el Ca2+i es una molécula muy importante que participa en los procesos fisiológicos de la capacitación y reacción acrosomal (RA). El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos del PFOA en el flujo de Ca2+i en la capacitación y RA del espermatozoide. Se determinó una CL50 teórica de 950 µM de PFOA y se consideraron a 478 y 190 µM como las CL50/2 y CL50/5, respectivamente. Sin embargo, 950 µM PFOA no fue letal para la mitad de la población expuesta a PFOA. En la movilidad no se observaron cambios en el porcentaje de espermatozoides hiperactivados, no obstante, se observó disminución del porcentaje y tamaño de aglutinados (60%) de forma dosis-dependiente. Asimismo con CTC, se observó que con PFOA (950 µM) se mantuvo un alto porcentaje de espermatozoides capacitados (85%) y reaccionados (19%). Al evaluar el efecto del PFOA en el flujo Ca2+i con el indicador fluorescente Fluo-3 AM durante la capacitación y RA, fue posible determinar 5 patrones con base en los que se determinó que a 950 µM de PFOA hubo una disminución en el porcentaje de espermatozoides capacitados (54%) y un incremento de los reaccionados (49%). Con citometría de flujo se determinaron tres poblaciones espermáticas: M1, M2 y M3; considerando M2 como espermatozoides no capacitados y M3 como capacitados y reaccionados. Con base en lo anterior, en la capacitación se observó disminución del índice de fluorescencia (IF), es decir del flujo de Ca2+i, de 28,636 a 20,116 en M3 con 950 µM PFOA. Asimismo, el IF en M3 en la RA inducida con 950 µM de PFOA disminuyó de 29,131 a 12,743 paralelo a un incremento en M2 de 6,415 a 15,153 en M2. 2 Aunque no fue posible determinar la CL50 real, con CTC se observó que el PFOA mantiene la capacitación y la RA, pero CTC es un indicador de Ca2+ de la membrana plasmática del espermatozoide, por lo que el uso de Fluo-3 AM proporcionó más información indicando una disminución en el porcentaje de espermatozoides capacitados debido al incremento de los reaccionados en presencia de PFOA, debido quizá a una movilización de Ca2+ de los almacenes intracelulares y del acrosoma que promovió y aceleró la RA o bien un influjo de Ca2+ a través de la activación de canales de Ca2+ tipo-L por cambios en el potencial de membrana, además de la posible producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), que también promueven la capacitación y RA. Asimismo, la desaglutinación de los espermatozoides, que es un indicador de capacitación, muestra que el PFOA posiblemente aceleró la capacitación. Contrario a las células somáticas donde el incremento no regulado de Ca2+i por PFOA puede ser letal para éstas, en espermatozoides estimuló la capacitación y RA, sin embargo, la aceleración de la RA espontánea e inducida en presencia de PFOA mostró que este compuesto podría comprometer la capacidad fertilizante del espermatozoide por lo que se requieren más estudios para un mejor entendimiento del mecanismo de acción del PFOA en la regulación del Ca2+i en el proceso de capacitación y RA del espermatozoide.