Formación de pronúcleos mediante la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) seleccionados por unión a la zona pelúcida en ovocitos de ovino activados químicamente - Hernández Pichardo, José Ernesto (Universidad Autónoma Metropolitana, 2017)
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) success is restricted by failure in oocyte activation and in sperm head decondensation with low male pronuclei (PN) formation. In order to improve ICSI, appropriate sperm selection and oocyte activation are necessary. The objective of the present study was to determine the efficiency of fertilization using ICSI with chemically activated ovine oocytes and sperm selected by “swim-up” or “swim-up” plus ZP binding. Three experiments were performed. In experiment 1, a total 821 in vitro matured oocytes were chemically activated with ethanol (EtOH), calcium ionophore (Ica) or ionomycin (Io), to determine female PN formation. The treatments showed similar results (54, 47, and 42%, respectively) and were higher (P<0.05) than mechanical (non-chemical) activated oocytes in the sham, ICSI, and sham injection (13, 25, 32%, respectively) (n= 429). Experiment 2 was conducted to determine the viability and acrosome status for fresh and frozen-thawed sperm. A total of 12 ejaculates and 28 straws of semen frozen-thawed were used. Sperm were selected by “swim-up” or “swim-up” plus ZP binding. A total of 2294 sperm from fresh semen and 2760 sperm from frozen-thawed semen were analyzed after either, “swim-up” or “swim-up” plus ZP binding. Sperm from fresh semen selected by “swim-up” showed an acrosome reaction (AR) of 59%, while the sperm selected by ZP binding had an increased of 91%. In comparison, the AR of frozenthawed sperm using “swim-up” or “swim-up” plus ZP binding was 77 and 86%, respectively. A difference was observed between the two sperm selection procedures (P<0.05). In experiment 3, fertility was evaluated based on the formation of two PN without the presence of a sperm head. The fertilization rate in 200 mechanical x activation oocytes was 4%, but the fertilization increased in EtOH activated oocytes after ICSI (12-28%). When fresh sperm selected only by “swim-up” were injected to 123 oocytes, a fertilization rate of 28% was achieved. In those sperm selected by “swim-up” plus ZP binding the fertilization rate of 73 oocytes was 25%. In comparison, for frozen-thawed sperm selected by “swim-up”, fertilization was 13% (70 oocytes), whereas using sperm from “swim-up” plus ZP binding resulted in 12% (51 oocytes) fertilization rate. No significant difference was observed between the two treatments. Conclusions: Chemical treatment with EtOH increased ovine oocyte activation. Besides, the fertilization rates increased after ICSI. Sperm selection with the “swimup” or “swim-up” plus ZP did not increase the fertilization rate with ICSI, although “swim-up” plus ZP it did induce a high percentage of AR, suggesting that it is not essential for fertilization in ovine oocytes. The use of fresh sperm was more efficient than frozen-thawed in terms of fertilization capacity using ICSI.; El éxito de la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) está restringido por falta de activación del ovocito y falla en la descondensación de la cabeza espermática, ocasionando baja formación del pronúcleo (PN) masculino. Para mejorar los resultados obtenidos por la ICSI, es necesaria una adecuada activación del ovocito y selección espermática. El objetivo del presente estudio fue determinar la eficiencia de la fertilización usando ICSI con activación química en ovocitos de ovino y seleccionando el espermatozoide por “swim-up” o “swim-up” más la unión a la zona pelúcida (ZP). Tres experimentos fueron realizados. En el experimento 1, un total de 821 ovocitos madurados in vitro, fueron activados químicamente con etanol (EtOH), ionóforo de calcio (Ica) o ionomicina (Io), para determinar la formación del PN femenino. Los tratamientos mostraron resultados similares (54, 47 y 42%, respectivamente), siendo más alta (P<0.05) que la activación mecánica de los ovocitos por medio de: sólo el manejo del ovocito, ICSI o falsa inyección (13, 25, 32%, respectivamente) (n= 429). El experimento 2, fue para determinar el estado acrosomal y la viabilidad de espermatozoides de semen fresco y congeladodescongelado. Un total de 12 eyaculados y 28 pajillas con semen congeladodescongelado fueron usadas. Los espermatozoides fueron seleccionados mediante “swim-up” o “swim-up” más la unión a la ZP. Un total de 2294 espermatozoides de semen fresco y 2760 espermatozoides de semen congelado-descongelado fueron analizados después de realizadas ambas técnicas. Los espermatozoides de semen fresco seleccionados por “swim-up” mostraron un 59% de reacción acrosomal (RA), mientras que en los seleccionados por medio de la unión a la ZP se incrementó a vii 91%. En comparación, la RA de los espermatozoides de semen congeladodescongelado usando “swim-up” o “swim-up” más la unión a la ZP fue de 77 y 86%, respectivamente. Se observó una diferencia significativa (P<0.05) entre los dos procedimientos de selección espermática. En el experimento 3, la fertilización fue evaluada con base en la formación de los dos PN sin la presencia de la cabeza espermática. El porcentaje de fertilización en 200 ovocitos activados mecánicamente fue de 4%, pero la fertilización se incrementó en ovocitos activados con EtOH después de la ICSI (12-28%). Cuando espermatozoides de semen fresco y seleccionado mediante “swim-up” fueron inyectados a 123 ovocitos, el porcentaje de fertilización fue de 28%; mientras que los espermatozoides seleccionados por “swimup” más la unión a la ZP, el porcentaje de fertilización de 73 ovocitos fue de 25%. En comparación con los espermatozoides congelados-descongelados y seleccionados por “swim-up”, la fertilización fue de 13% (70 ovocitos), mientras que usando espermatozoides seleccionados por “swim-up” más su unión a la ZP resultó en un 12% de fertilización (51 ovocitos). No se observó diferencia significativa entre las dos técnicas de selección. Conclusiones: La activación química con EtOH incrementó la activación en ovocitos de ovino, además después de la ICSI incrementó el porcentaje de fertilización. La selección de espermatozoides mediante “swim-up” o “swim-up” más su unión a la ZP no aumentó el porcentaje de fertilización con ICSI, aunque “swim-up” más su unión a la ZP, indujo un alto porcentaje de RA, lo que sugiere que no es esencial para la fertilización en ovocitos de ovino. El uso de espermatozoides de semen fresco fue más eficiente que los espermatozoides congeladosdescongelados en términos de capacidad de fertilización usando ICSI.