Producción de invertasa por Aspergillus niger en fermentación líquida y fermentación sólida - Romero Gómez, Sergio de Jesús (Universidad Autónoma Metropolitana, 2001)
The purpose of the present study was to compare the productivity of a fungal enzyme, invertase (sucrase o 13 fructo-furanosidase EC3.2.1.26) of Aspergillus niger grown in solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF). Poliurethane foam was used as inert support in SSF experiments. One of the objectives was to evaluate the effect of increasing initial sucrose concentrations as invertase inducer and sole carbon source. The following physiological parameters were evaluated: specific: growth rate (p.), maximal biomass (X,), biomass yields per substrate gram (YWS), enzyme yields per gram biomass (Y,) and culture productivity (P) from solid and submerged fermentations. A comparison of the above parameters was done to evaluate whether the higher productivity of SSF cultures is related to one or several of the growth and production parameters. The obtained results shown that in solid fermentation, biomass production was much higher than in liquid fermentation even when subsltrate consumption was comparable in both fermentation systems. This result was much more notable for higher substrate concentrations (higher than 50 g/l). Biomass yie1d.s were much higher in solid than in liquid state fermentation with a decreasing tendency as the substrate concentration was increased. Specific speed growth (p.) was higher to solid than in liquid fermentation at all sucrose concentrations tested. Invertase titers were higher in SSF than in SmF as well. At low sucrose concentrations (between 6.25 to 25 g/!) invertase productivity was comparable in both fermentation systems. However, at high initial sucrose concentration (100 g/¡) invertase productivity was 5 times higher in SSF than in SmF. Enzyme yield per gram of biomass (YEM) was much higher in SSF than in SmF. When sugar composition of the culture broth was analyzed, glucose and fructose were found to accumulate at higher concentrations in SmF than in SSF cultures. This can be related to slower growth in SmF cultures. Extracellular protease levels were measured in order to assert its effect on the stability of invertase activity in the cultures. Proteolytic activity was 6.5 times lower in SSF than in SmF. However these differences could not directly related to differences in invertase stability in the cultures. In liquid cultures, Aspergillus niger grew In the form of pellets. In SSF Aspergillus niger grew as disperse mycelia adhering in part o the polyurethane foam and growing in part as airea1 mycelia. Microscopic observation of liquid media within polyurethane cubes showed a liquid layer with thickness of 60 pm within the holes of polyurethane cubes. Knowing that the amount of liquid added per gram of polyurethane was 25 mi, a surface area of 4000 crn2 could be calculated. This means that in SSF the surface volume relation was 160 cm2/cm3, meanwhile in SmF this relation was 1 .O cm2/cm3. This represents a surface interchange 300 times bigger for SSF than for SmF cultures. According to these results, the following conclusions were supported: 1. Aspergillus niger grows faster, with higher biornass maximal and higher biomass yields in SSF than SmF 2. Invertase production is at least partially associated to biomass production In both culture systems. Therefore the higher enzyme productlvlty of SSF IS related to the higher and faster biomass production. 3. SSF cultures on PUF grows as dispersed mycelia with a big air space and a gas interchange space 160 times bigger in SSF thlan in SmF, meanwhlle SmF cultures grows as pellets with a very dense center. Therefore culture conditions and growth type uphold and difficult oxygen transfer in SSF and SmF respectlvely.; En este estudio se comparó la producción de la enzima invertasa (sacarasa o 13 fructo-furanosidasa EC3.2.1.26) por una cepa silvestre de Aspergillus niger C28825 usando medio líquido y sólido. Se utilizó espuma de poliuretano como soporte inerte para fermentación sólida y se propone corno un sistema modelo para el estudio de las diferencias entre fermentación sólida y líquida. El objetivo principal fue la evaluación del efecto de la adición de cantidades crecientes de sacarosa que actuase, simultáneamente como inductor de ésta enzima y única fuente de carbono. Se midieron los siguientes parámetros fisiológicos: la velocidad específica de crecimiento del organismo (p), el nivel máximo de la biomasa (X,), el rendimiento de biomasa por gramo de substrato consumido (VX/S), el rendimiento enzimático por gramo de biomasa producida (Yux) y la productividad de la enzima enzimática (P). Con la comparación de estos indices se pretende demostrar silamayor productividad enzimática del medio sólido se debe la mayor producción de biomasa o a una mayor producción enzimática por gramo1 de biomasa y si esto se puede relacionar con la forma de crecimiento del micelio dentro de cada medio de fermentación. LOS resultados obtenidos indicaron que, en fermentación sólida, la biomasa producida fue mayor que en fermentación líquida, aunque el consumo de substrat0 fue muy similar en ambos medios. Esto fue m& notable cuando se usaron altos niveles de sacarosa (SO > 50 g/L). Es decir, los valores de YNs, corno función de So, fueron mayores para la fermentación sólida que para la liquida con todos 10s niveles de sacarosa. Además, las tendencias de la p fueron diferentes entre los dos tipos de fermentación (mayor para el medio sólido). Los niveles máximos de la invertasa fueron mucho mayores en fermentación sólida que los obtenidos por fermentación líquida, con sacarosa inicial mayor a 25 g/l. La productividad de la enzima pasó de ser casi igual con 6.25 gll de sacarosa inicial para ambos tipos de cultivo, a ser 5 veces mayor en fermentación sólida, cuando se aiiadieron 100 gll de sacarosa inicial. El rendimiento de la enzima por gramo de biomasa (Yvx) fue mayor en medio sólido que en medio líquido. Todas estas diferencias fisiológicas se acentuaron cuando los niveles de sacarosa fueron altos. AI estudiarse la composición de azúcares del caldo de cultivo con 100 g/l de sacarosa inicial, se encontró que en el medio líquido se acumulaban más la glucosa y la fructosa, que en el medio sólido. Esto indica una velocidad de hidrólisis mayor a la capacidad de producción de biomasa en el medio líquido durante las primeras horas del cultivo. Por otra parte, se midieron los niveles de actividad de proteasa para comparar el efecto del sistema de cultivo sobre la estabilidad de la invertasa, la actividad proteolítica fue 6.5 veces menor en la fermentación sólida que en la fermentación líquida. Los cultivos de Aspergillus niger en medio líquido produjeron agregados esféricos o “pelotitas” (“pellets”) que son la forma macroscópica característica en este medio. Pero en medio sólido, este organismo creció en forma de un micelio disperso adherido en parte a las trabeculas del polímero y cm parte en forma de micelio aéreo en contacto directo con la fase gaseosa. La observación microscópica de poliuretano mezclado con el medio líquido mostró que éSta formaba meniscos con un espesor cercano a 60 vm. y que esta medida corresponde ;a la dispersión de 25 ml de agua en un gramo de poliuretano, en una superficie de aproximadamente 4,000 cm2. Es decir que el cociente de la superficie sobre el volumen fue de AN =160 cm2/cm3. En cambio, la medición del área de contacto del medio en matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio indicó una relación AN = 1 .O cm2/cm3. Es decir, la superficie de transferencia de gases en el medio líquido. De acuerdo con estos resultados, es posible apoy<ar las siguientes conclusiones: l. Aspergillus niger crece más rápidamente, con una mayor biomasa máxima y con un mayor rendimiento de biomasa por gramo de substrato consumido en fermentación sólida que en fermentación líquida. 2. La producción de invertasa está al menos parcialmente asociada a la producción de biomasa en ambos tipos de cultivo. Por lo tanto, la mayor productividad de los cultivos de fermentación sólida se debe, a la mayor y más rápida producción de biomasa en este tipo de fermentación. 3. Los cultivos de fermentación sólida en poliuretano, presentan crecimiento en forma de micelio disperso con un gran espacio aéreo y una superficie de intercambio gaseoso 160 veces mayor clue en líquido. los cultivos de fermentación líquida presentan pellets con centros muy densos. De manera que las condiciones de cultivo y el tipo de crecimliento favorecen la transferencia de oxígeno al interior de la biomasa en fermentación sólida y la dificultan en fermentación líquida.