Evaluación de métodos de inmovilización de enzimas para la construcción de biosensores - Rodríguez Sevilla, Erika (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
En esta investigación se describe la caracterización cinética y analítica de biosensores, elaborados sobre electrodos de tipo screen-printed (ESP) utilizando laccasa de Trametes versicolor, o tirosinasa mushroom como elementos de reconocimiento ambas son el atrapamiento, el reticulado y el enlace covalente en seis condiciones experimentales diferentes (ver Tabla I). Cada uno de ellos se caracteriza mediante Voltamperometría Cíclica, Espectroscopia Ultravioleta Visible, Amperometría y Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). La caracterización electroquímica y espectrofotométrica se realiza a (30.0±0.5) °C y pH = 4.70 ±0.01 impuesto con amortiguador de acetatos 0.1 M, la constante de MichaelisMenten aparente (Km´), para la oxidación enzimática de hidroquinona (HQ) a p-quinona, (pQ), es usada como parámetro de comparación, ya que provee información tanto de los parámetros de la cinética enzimática como de los parámetros analíticos ligados directamente con el biosensor. Después de comparar los distintos métodos de inmovilización, se encuentra que el mejor método de inmovilización es el reticulado utilizando glutaraldehído al 2.5% a 40°C, obteniendo una Km´ de 170±3 µM, y un límite de detección de HQ de 17±6 µM, su tiempo de fabricación es de 1.5 horas y tiene un tiempo de vida > 5 meses almacenado a temperatura ambiente. Para analizar el efecto de la enzima sobre el método de inmovilización se fabricaron biosensores con las mismas condiciones experimentales mencionadas anteriormente utilizando ahora tirosinasa mushroom (Tm) como elemento de reconocimiento (Tabla II). Cada uno de estos biosensores fue caracterizado mediante Voltamperometría Cíclica, Espectroscopia Ultravioleta Visible, Amperometría, Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (EIS) y Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). De la caracterización amperométrica se obtiene la constante de Michaelis-Menten aparente, K´m, de cada biosensor, mientras que de las mediciones de la impedancia se obtiene la resistencia a la transferencia de carga, Rtc, de los biosensores caracterizados. Se encontró que el biosensor ESP/Tm/GA 2.5% tiene la K´m = (57±7) M y los valores de Rtc, más bajos, Con el fin de mejorar la transferencia electrónica, se diseñaron biosensores de tipo screenprinted con electrodos de trabajo de 0.7 cm2 de área, sin embargo la membrana polimérica al inmovilizar mediante atrapamiento y reticulado solo cubre el 30%, 70% y 100% del área del electrodo de trabajo. Utilizado LTv como elemento de reconocimiento se encuentra que los biosensores que tienen el 70% del área cubierta por la membrana polimérica, mejoran los parámetros cinéticos (Km´ y Imax) y los parámetros analíticos del biosensor (límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad, intervalo lineal, etc.) Usando los biosensores ESP/LTv/GA 2.5% y ESP/Tm/GA 2.5%, se determina la capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC) para las infusiones preparadas con Mirto (Salvia microphylla), Hierba San Cayetano (Solanum rudepannum), Muicle (Justicia spicigera), Hierba dulce (Lippia dulcis) y Salve Real (Lippia alba); plantas medicinales de uso común en México. En este trabajo se obtiene que Mirto es una planta rica en compuestos fenólicos para-sustituidos pues se obtiene un mayor TEAC al utilizar el biosensor de LTv, mientras que el resto de las infusiones estudiadas muestran una composición de compuestos orto- y meta-sustituidos mayor al obtener un TEAC mayor con el biosensor de Tm.; A biosensor’s detection principle is based on the specific interaction between the compound of interest and the recognition agent. As result of such bond, one or more physicochemical properties varies (pH, transport of electrons, heat, potential difference, mass, optical properties variation, etc.) that is detected through the transductor. This system transforms the recognition agent’s response into an electronic signal thus indicating the analytes’ concentration in the sample. With the passage of time, the sensors required have become inexpensive, practical and easy to use; presently, the most common biosensor is the glucose biosensor, used by diabetics. Among the latest developments, the devices that are now constructed use the technology called "thick film". These biosensors are formed with ink or paste layers sequentially deposited on a support or substrate. A key factor that distinguishes this technology is the screen-printing method responsible of depositing the film. The present research project describes the fabrication and characterization of biosensors made with screen-printed type-electrodes (SPE) using Trametes versicolor Laccase (TvL) and mushroom Tyrosinase (mTyr), immobilized through entrapment, cross-linking and co-crosslinking covalent bond methods, and its implementation for the determination of the antioxidant capacity of medicinal plants in the state of Guerrero, Mexico. The Laccase immobilization from Trametes versicolor (TvL) by means of entrapment, cross-linking and covalent bonding methods is analyzed through the development and characterization of amperometric screen-printed sensors for phenolic compounds. In order to perform the immobilization with each of the methods stated, polyvinyl alcohol (PVA), glutaraldehyde (GA) and N-ethyl-N’-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide clorhydrate (EDC), were used respectively; the electrochemical characterization was carried out at (30.0 ± 0.5) °C and pH = 4.70 ± 0.01. The apparent MichaelisMenten constant, Km´, for the enzymatic oxidation of hydroquinone, HQ, to p-quinone, p-Q, was used as comparison parameter, to provide information on the enzymatic kinetic parameters, as well as the analytic parameter linked directly to the biosensor. After comparing the different immobilization methods, it became apparent that the best one was cross-linking at 40 °C, that gave the lowest Km´ ((170.1 ± 3.2) µM), and HQ limit of detection ((17.0 ± 6.6) µM) values. The antioxidant capacity of real samples from infusions of medicinal plants, was evaluated using this biosensor. The working area of a screen-printed electrode, SPE, was modified with the Tyrosinase enzyme (Tyr) using different immobilization methods, namely: entrapment, with water soluble polyvinyl alcohol, PVA, cross-linking using glutaraldehyde, GA, and cross-linking using GA and Human Serum Albumin, HSA; the resulting electrodes were termed SPE/Tyr/PVA, SPE/Tyr/GA and SPE/Tyr/HSA/GA, respectively. These biosensors were characterized by means of amperometry and EIS techniques. From amperometric evaluations, the apparent Michaelis-Menten constant, Km´, of each biosensor was evaluated while the respective charge transfer resistance, Rct, was assessed from impedance measurements. It was found that the SPE/Tyr/GA had the smallest Km´ (57 ± 7) M and Rct values. This electrode also displayed both the lowest detection and quantification limits for catechol quantification. Using the SPE/Tyr/GA, the Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) was determined from infusions prepared with “Mirto” (Salvia microphylla), “Hierba dulce” (Lippia dulcis) and “Salve Real” (Lippia alba); medicinal plants commonly used in Mexico. The determination of the antioxidant capacity give qualitative information about the chemical composition of the samples analyzed, obtaining that Mirto is a plant rich in phenolic compounds parasubstituted, while the rest of the infusions studied show a high composition of ortho and meta substituted compounds.