Estudio fisiológico de la nitrificación en presencia de 2-Clorofenol utilizando un consorcio nitrificante - Pérez Alfaro, Jesús Emmanuel (Universidad Autónoma Metropolitana, 2015)
En esta tesis se estudió el efecto del 2-clorofenol (2-CP) sobre los procesos de amonio y nitrito oxidación así como el consumo de 2-CP por un consorcio nitrificante, utilizando variables de respuesta como la eficiencia de consumo, el rendimiento de producción y las velocidades específicas de los procesos. Para tal propósito este documento se divide en tres etapas principales. En la primera se llevaron a cabo diferentes ensayos en cultivos en lote diseñados para evaluar la actividad de amonio y nitrito oxidación de manera independiente usando amonio o nitrito como fuente de nitrógeno y energía, respectivamente. Posteriormente se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de 2-CP (2.5, 5 y 10 mg C-2-CP/l) sobre estas rutas oxidativas y la capacidad del consorcio nitrificante para recuperar la actividad amonio y nitrito oxidante tras el contacto con el 2-CP. La segunda etapa de este estudió se enfocó en evaluar el posible efecto de 5 mg de C-2-CP/l en el transporte de amonio hacia dentro de la célula. Se realizaron experimentos en lote donde la concentración de nitrógeno de amonio (N-NH4 + ) se incrementó de 100 a 200, 300 y 500 mg/l. Con el objetivo de generar mayor información que permitiera determinar si el efecto de 2-CP es a nivel enzimático o de transporte de sustratos, se realizaron ensayos con extractos libres de células. Dichos extractos se obtuvieron a partir del consorcio nitrificante mediante una técnica diseñada en el laboratorio, los extractos conservaron cerca del 80% de la actividad amonio y nitrito oxidante original (en comparación con las células completas) por un periodo de 24 horas. Por último, se evaluó la participación de las enzimas amonio monooxigenasa (AMO) y nitrito oxidoreductasa (NOR) en el consumo de 2-CP. Para lo cual se utilizaron inhibidores específicos de la AMO y NOR (aliltiourea y clorato de sodio respectivamente). Se evaluó además el efecto de la concentración de amonio en el consumo de 2-CP. En la primera etapa se observó en presencia de 2-CP que la amonio oxidación puede ser inhibida totalmente con una concentración de 2.5 mg C-2-CP/l. Por su parte, la nitrito oxidación se inhibió a partir de una concentración de10 mg C2-CP/l, se observó que las velocidades de consumo de nitrito y producción de nitrato disminuyeron más del 50%. Cuando se incubó con 2-CP durante 40 días, se observó que ambas rutas oxidantes pueden restablecerse, pero solo Jesús Emmanuel Pérez Alfaro | X de manera parcial. Para ello se requiere de una fase de retardo que puede ser de hasta 120 horas para la amonio oxidación y de cerca de 50 horas para la nitrito oxidación. Es importante mencionar que el consorcio microbiano presentó la capacidad de consumir el 2-CP independientemente de su concentración inicial, con la previa necesidad de fases de retardo, cuya duración pudiera ser dependiente de la concentración de 2-CP. Los ensayos de la segunda etapa mostraron que con 200 y hasta 500 mg NNH4 + /l, y luego de 48 horas de cultivo, el consorcio microbiano conservó la capacidad de consumir amonio y de oxidarlo a nitrito y nitrato aún en presencia de 5 mg C-2-CP/l. Sin embargo también se observó que las velocidades específicas de consumo de amonio y producción de nitrito y nitrato disminuyeron más del 70% en promedio, lo que podría indicar un daño causado por el 2-CP a nivel de la membrana celular, ya que al parecer el 2-CP altera o detiene el transporte de amonio. En los resultados obtenidos con los ensayos con extracto libres de células a diferencia de los ensayos con las células completas, sí se observó la oxidación de 100 mg N-NH4 + /l en presencia de 5 mg C-2-CP/l de manera inmediata pero también se observó que la velocidad específica de los procesos amonio oxidante y nitrito oxidante puede disminuir hasta 40 y 38% respectivamente en presencia de 2-CP. Por lo anterior puede decirse que el 2-CP podría afectar el proceso amonio oxidante a nivel membrana y a nivel enzimático. Además de los resultados ya descritos, se observó que el consorcio nitrificante tuvo la capacidad de consumir 2-CP en todos los casos y con todas las concentraciones evaluadas, requiriendo de fases de retardo de 12, 15 o hasta 30 días, por lo cual se evaluó la participación de la AMO y NOR en el consumo de 2-CP. En los ensayos con inhibidores específicos de la AMO (aliltiourea) y NOR (clorato de sodio), se observó que la velocidad específica de consumo de 2-CP en ausencia de inhibidores o en presencia de clorato de sodio, no presentó diferencia estadísticamente significativa, es decir la NOR no tiene participación en el consumo de 2-CP. Mientras que al inhibirse la AMO en presencia de aliltiourea, la velocidad específica de consumo de 2-CP disminuyó cerca del 50%, con lo cual se pudo concluir que la AMO podría tener participación importante en la oxidación de 2-CP. También se observó que la Jesús Emmanuel Pérez Alfaro | XI concentración de amonio puede estimular el consumo de 2-CP, ya que al aumentar la concentración de amonio a 500 mg N-NH4 + /l, el consumo de 2-CP cambió drásticamente, pues de requerirse fases de retardo de 12 a 30 días para el consumo total de 5 mg C-2-CP/l, con 500 mg N-NH4 + /l la fase de retardo no fue requerida y el consumo de más del 80% del 2-CP se realizó en un tiempo de 48 horas. Estos resultados pueden contribuir en el entendimiento de los factores que pueden dificultar el tratamiento de aguas residuales con altas concentraciones de amonio y que contengan compuestos semejantes al 2-CP.; The effect of 2-chlorophenol on the ammonium and nitrite oxidation and 2- chlorophenol (2-CP) oxidation processes by a nitrifying consortium were studied, using consumption efficiency, production yield and specific consumption and production rates as response variables. For this purpose this thesis was divided into three main stages. In the first, batch culture assays were carried out to study the ammonium and nitrite oxidation processes independently, using ammonium or nitrite as nitrogen and energy source. Then the effect of different concentrations of 2-CP (2.5, 5 and 10 mg 2-CP-C/l) on these oxidative pathways was evaluated. Furthermore the ability of nitrifying consortium to recover ammonium and nitrite oxidizing activity after contact with the 2-CP was studied. The second stage of this study was focused on evaluating the potential impact of 5 mg of 2-CP-C/l on ammonium transport. Batch experiments were performed. The concentration of ammonium nitrogen (NH4 + -N) was increased to 200, 300 and 500 mg/l. In order to generate more information to establish the level where 2-CP could cause damage, assays with cell free extracts were performed. The cell free extracts generated retained up to 80% of the original ammonium and nitrite oxidation activity (compared to whole cells) for a period of 24 hours. Finally, the participation of ammonium monooxygenase (AMO) and nitrite oxidoreductase (NOR) enzymes during 2-CP consumption was evaluated. Specific inhibitors of AMO and NOR (allyltiourea and sodium chlorate, respectively) were used. Furthermore the effect of ammonium concentration in 2-CP consumption was evaluated. The experimental conditions for conducting ammonium and nitrite oxidation were established in the first stage. It was observed that ammonium oxidation can be inhibited by 100% at 2.5 mg 2-CP-C/l since no nitrifying activity was observed throughout the culture time of 40 days. It was concluded that 2-CP affected ammonium oxidation at physiological and kinetic level. A negative effect of 10 mg 2-CP-C/l was observed in the kinetics of nitrite oxidation, as nitrite consumption and nitrate production rates decreased more than 50%. After contact with 2-CP for 40 days, it was observed that both oxidizing pathways can be partially restored as lag phases up to 120 h for ammonium and about 50 h for nitrite oxidation were required. In all cases the microbial Jesús Emmanuel Pérez Alfaro | XIII consortium was able to consume 2-CP regardless its initial concentration. Nevertheless, different lag phases were needed apparently depending on the concentration of 2-CP. Assays in the second stage, showed that even in the presence of 5 mg 2-CP-C/l the increment in ammonium concentration of 100 to 200, 300 and 500 mg NH4 + - N/l resulted in the microbial consortium ability to consume ammonium and oxidized it to nitrite and nitrate within 48 h of culture. Nevertheless, consumption and production rates of ammonium, nitrite and nitrate decreased more than 70%. Thus apparently 2-CP has an effect on the cell membrane that alters or stops the ammonium transport. The results obtained in assays with free cell extract showed that in contrast to assays with whole cells, the oxidation of 100 mg NH4 + -N/l was possible and immediately in presence of 5 mg 2-CP-C/l. However, specific rates of ammonium consumption and nitrate production decreased to 40 and 38% respectively in the presence of 2-CP. Therefore it could be concluded that 2-CP may affects ammonium oxidizing process at membrane and enzyme level. In addition to the results described above, it always was observed that the nitrifying consortium was able to consume the different 2-CP concentrations requiring lag phases of 12, 15 or 30 d. Therefore in a third stage the participation of AMO and NOR in consumption of 2-CP was evaluated. In assays with specific inhibitors of AMO and NOR it was observed that the specific consumption rate of 2-CP in absence of inhibitors or in the presence of sodium chlorate did not show statistical difference. Therefore, NOR has no participation in 2-CP consumption. Contrary, the specific consumption rate of 2- CP decreased about 50% when the AMO was inhibited in the presence of allyltiourea, suggesting that the AMO may have an important role in the 2-CP consumption. Finally the ammonium concentration may lead a positive effect on 2-CP consumption, since increasing the ammonium concentration to 500 mg NH4 + -N/l resulted in 5 mg 2-CP-C/l consumption close to 80% within 48 h without lag phase. These results can aid in improving the treatment of wastewater with high concentrations of ammonia and containing compounds similar to 2-CP.