Síntesis de fucooligosacáridos empleando α-L-fucosidasas microbianas: estudio in vitro e in silico - Pavón Chimal, Mauricio Eduardo (Universidad Autónoma Metropolitana, 2023)
Some of the benefits provided by human milk to infants are attributed to the oligosaccharides it contains. Most of these oligosaccharides are fucosylated and mainly produce a prebiotic action, promoting the selective growth of bifidobacteria in the gastrointestinal tract, which is why there is interest in synthesizing them to take advantage of their biological activity. One of the methods available to synthesize them is enzymatic synthesis using glycosyl hydrolases such as α-L-fucosidase. The fucosidases belonging to the GH29 family are those that have shown greater ability to carry out the transfucosylation reaction. In the present work, an in silico study was carried out to study the differences between two α-L-fucosidases from the GH29A subfamily belonging to Thermotoga maritima and Lacticaseibacillus casei, as well as one of the GH29B subfamily belonging to Bifidobacterium longum subsp. infantis, identifying differences in the active site that are related to the affinity with the fucosyl donor substrate, para-nitrophenyl fucose. Furthermore, a simulation of the synthesis reaction of fucosylated oligosaccharides was carried out by molecular docking with the α-L-fucosidase from T. maritima, finding favorable binding sites for the acceptor substrate lactose, that are occupied before the substrate approach the active site. Subsequently, the interaction between the α-L-fucosidase from B. longum subsp. infantis with the donor substrates 2'- fucosyl lactose and 3-fucosyl lactose were examinated, as well with lactose and lactulose as acceptor substrates, verifying that it is theoretically possible to carry out the transfucosylation reaction with this enzyme. Finally, the synthesis of fucosylated oligosaccharides was carried out in vitro, employing an B. longum enzymatic extract, and using para-nitrophenyl fucose as a fucosyl donor substrate and lactose, lactulose, galactose and fructose as acceptor substrates, obtaining yields of 0.046%, 0.16%. 0.32% and 2.4% respectively, confirming the transfer of fucose to fructose through the acid hydrolysis of the fucose-fructose disaccharide, obtaining an equimolar proportion of 0.9: 1. Keywords: Bifidobacteria, α-L-fucosidase, fucooligosaccharides, transfucosylation.; Algunos de los beneficios proporcionados por la leche humana a los lactantes se atribuyen a los oligosacáridos que posee. La mayor parte de estos oligosacáridos se encuentran fucosilados y cuentan principalmente con actividad prebiótica, promoviendo el crecimiento selectivo de bifidobacterias en el intestino, por lo que existe interés en producirlos para aprovechar su actividad biológica. Uno de los métodos disponibles para la obtención de oligosacáridos fucosilados es la síntesis enzimática mediante glicosil-hidrolasas como la αL-fucosidasa. Las fucosidasas pertenecientes a la familia GH29 son las que han demostrado una mayor aptitud para realizar la reacción de transfucosilación. En el presente trabajo, se realizó un estudio in silico para estudiar las diferencias entre dos α-L-fucosidasas de la subfamilia GH29A pertenecientes a Thermotoga maritima y Lacticaseibacillus casei, así como una de la subfamilia GH29B perteneciente a Bifidobacterium longum subsp. infantis, identificando diferencias en el sitio activo que se relacionan a la afinidad con el sustrato donador de fucosilo, para-nitrofenil fucosa. Además, se llevó a cabo una simulación de la reacción de síntesis de oligosacáridos fucosilados mediante acoplamiento molecular con la α-L-fucosidasa de T. maritima, encontrando sitios de unión favorables para el sustrato aceptor lactosa que se ocupan antes de que el sustrato se aproxime al sitio activo. Posteriormente se evaluó in silico la interacción entre la α-L-fucosidasa de B. longum subsp. infantis con los sustratos donarores 2’-fucosil lactosa y 3-fucosil lactosa, así como con lactosa y lactulosa como sustratos aceptores, verificando que teóricamente es posible realizar la reacción de transfucosilación con esta enzima. Finalmente se realizó la síntesis de oligosacáridos fucosilados in vitro, empleando un extracto enzimático de B. longum, utilizando para-nitrofenil fucosa como sustrato donador de fucosilo y lactosa, lactulosa, galactosa y fructosa como sustratos aceptores, obteniendo rendimientos de 0.046%, 0.16 %, 0.32% y 2.4 % respectivamente, logrando confirmar la transferencia de fucosa a fructosa mediante la hidrólisis ácida del disacárido fucosa-fructosa, obteniendo una proporción equimolar de 0.9 : 1. Palabras clave: bifidobacteria, α-L-fucosidasa, fucooligosacáridos, transfucosilación.