Crecimiento volumétrico de células de músculo esquelético y motoneuronas de ratón en fibras electrohiladas de PLA y PLA-PPy - Zuñiga Aguilar, Esmeralda Sarai (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
El objetivo de este trabajo es el crecimiento volumétrico de células de músculo esquelético y motoneuronas primarias de ratón, sobre camas de fibras electrohiladas recubiertas con Poli-Pirrol por Plasma (PPy). Se realizaron diferentes técnicas para la obtención de células musculares y de motoneuronas de ratón. Las células de músculo esquelético se obtuvieron de las extremidades de neonatos de ratón, éstas fueron sometidas a procesos de purificación de fibroblastos para la obtención exclusiva de mioblastos. Una vez obtenidos los mioblastos, se diferenciaron hacia miotubos. Se realizaron ensayos de alineación y crecimiento de células musculares, utilizando rieles de silicón sobre cajas de cultivo y cubreobjetos tratados con PPy, obteniéndose en ambos casos un crecimiento celular alineado y la formación de miotubos después de la diferenciación celular. Al realizar pruebas electrofisiológicas y morfológicas, se obtuvieron en ambas superficies de cultivo, corrientes iónicas y potenciales de acción. Se observó por inmunofluorescencia la presencia de miosina en los miotubos. Se realizaron tres protocolos para la obtención de un adecuado modelo de motoneurona. El primero fue la diferenciación de células troncales de ratón hacia motoneuronas utilizando Matrigel y PPy como superficies de cultivo y diferenciación, siendo una técnica larga y complicada, en donde solo se llegó a obtener un 16% de células completamente diferenciadas; en ambas superficies se presentaron las mismas tasas de diferenciación y de supervivencia. El segundo protocolo, fue la obtención de células nerviosas de la médula espinal de ratón, las células fueron sembradas en Poli-DL-Ornitina/Laminina y en PPy. En este protocolo se obtuvo un cultivo de diferentes tipos celulares, pero las condiciones de cultivo se realizaron para la supervivencia en específico de motoneuronas. Se realizaron pruebas electrofisiológicas, morfológicas y de viabilidad, presentándose una ventaja muy clara en los cultivos de células nerviosas sembradas en PPy en donde las células se mantuvieron en adecuadas condiciones fisiológicas hasta por 21 días. El tercer protocolo fue el de purificación de motoneuronas, el cual nos permitió obtener motoneuronas que crecieron sobre cajas tratadas con Poli-DL-Ornitina/Laminina y sobre cubreobjetos polimerizados sobre PPy. Se obtuvo un adecuado crecimiento celular en ambas superficies, al realizar las pruebas electrofisiológicas y morfológicas se obtuvieron corrientes iónicas y potenciales de acción. Se observó por inmunofluorescencia la presencia de transportadores vesiculares de acetilcolina, proteína exclusiva de motoneuronas. Se realizó el cocultivo celular de miotubos y motoneuronas sobre Poli-DLOrnitina/Laminina y sobre PPy, se observó por inmunofluorescencia la formación de sinapsis neuromuscular al marcar la placa neuromuscular con alfa-bungarotoxina. Por lo que este fue el protocolo utilizado para la realización de los crecimientos volumétricos de motoneuronas, debido a la facilidad de obtención de un cultivo homogéneo de motoneuronas que presentan todas las características fisiológicas reportadas en la literatura Una vez obtenidos los modelos celulares adecuados, se prosiguió a realizar el crecimiento volumétrico celular. Se utilizaron camas de fibras alineadas de PLA, fabricadas por la técnica de electrohilado, polimerizadas y sin polimerizar por PPy. Las fibras electrohiladas sirvieron como superficie de crecimiento celular para ambos tipos celulares, permitiendo el crecimiento volumétrico de mioblastos diferenciados a miotubos y de motoneuronas. Las pruebas electrofisiológicas en el crecimiento 3D de motoneuronas, revelaron la presencia de actividad eléctrica en las motoneuronas. Las pruebas morfológicas por inmunofluorescencia en ambos cultivos tridimensionales de músculo y motoneuronas, mostraron el anclaje y crecimiento celular sobre las fibras electrohiladas de PLA y PLAPPy, así como la presencia de proteínas específicas, como de miosina en células musculares y de transportadores vesiculares de acetilcolina en motoneuronas. El uso de PPy en el cultivo bidimensional y tridimensional no altera las características propias de las células. Éste permite el crecimiento y diferenciación celular, ayudando a las células a tener un mejor anclaje y por la tanto, en algunos casos promueve el tiempo de vida de las células en cultivo, lo cual no altera sus propiedades eléctricas, morfológicas, de síntesis de proteínas y de neurotransmisores.