Inducción y represión de la síntesis de la tanasa de Aspergillus niger Aa-20 en cultivo en medios líquido y sólido - Aguilar González, Cristóbal Noé (Universidad Autónoma Metropolitana, 2000)
This work evaluates the differences in the production profile:; of hydrolytic enzymes, when them are produced by liquid and solid state cultures. Such differences were described in the last decade with different enzymes. However, the causes that originate the obtaining of different titers of enzymatic activity have generated a great controversy. In this study, the tannase produced by Aspergillus niger Aa20 was used as model of study. Tannic acid was used as inductor and the glucose as repressor of the tannase activity. Additionally, the effect of the gallic acid in the synthesis of the tannase in liquid culture was evaluated. To explain the capacity of the solid culture to minimize the catabolic repression of the enzymatic activity, the evaluation criterion taken was the comparison of production patterns in both induction and repression conditions of enzyme synthesis in liquid and solid state cultures. The results obtained in the production of the tannase demonstrated that the reached activity titles are higher (up to 6 times) in solid culture than liquid culture. Productivity was higher from 2 to 7 times in solid culture when tannic acid was only used, and up to 4 times with tannic acid and glucose. Combined analysis of the kinetic parameters (O YEIX Xmax) indicated that the value of productivity is strongly influenced by YE/X and not by Xmax or 11, as reported for other enzymes. However, the differences in such last parameters were important in liquid culture.with tannic acid (Xmax) and with glucose-tannic acid ([I), in comparison with those obtained in solid culture. In liquid culture the tannase activity was unstable, and this was clearly associated to presence of protease activities (at least 6 times higher in liquid culture than solid culture. Both tannase activities, intracellular and extracellular followed the Luedeking and Piret model, obtaining negative values of constant k (association rate of product to biomass formation) ) in liquid culture, and postive values in solid culture with tannic acid as sole carbon source. Negative values of k were related to decomposition rate of tannase in the culture medium by prol.eases, whilst the increment of tannase activity in solid culture as function of substrate concentration, coincided with the positive values of k in solid culture. The induction and repression patterns of the tanlnase were clearly different in both culture systems. High concentrations of tannic acid (higher than 25 gL") affected seriously the ratio of induction of the tannase in liquid culture, while in the solid culture favored the expression of the enzymatic activity. Maximum induction ratio in liquid culture was around 4, whilst in solid culture was 17. The addition of low concentrations of glucose (lower than 50 gL-I) caused the catabolic repression of the tannase in liquid culture. In solid state culture, the use of high concentrations of glucose affected the ratio of enzymatic induction seriously, although the phenomenon of catabolic repression was not presented. Finally, it was found that the gallic acid could be a repressor for final product in the tannase synthesis in liquid culture.; Este trabajo trata de aclarar en términos de la fisiología microbiana, cuáles son los factores dominantes que explican una mayor productividad de las enzimas excretadas por cultivos microbianos desarrollados en medio sólido comparados con los cultivos en medio líquido. Esto fue evidenciado desde 1991 para el caso de gluco-amilasa producida por Bacillus lichenifomis M27 y ha sido corroborado por otros investigadores. Sin embargo, hasta muy recientemente no se había intentado explicar estas diferencias como asociadas a coeficientes cinéticos tales como, la tasa específica de crecimiento, 1-1, el factor de rendimiento de la enzima (YEIx), el nivel máximo de la biomasa (Xmax) o la tasa específica de destrucción de la enzima en el medio (k). Para ese fin, se decidió estudiar la producción de la enzima tanasa (tanin acil, hidrolasa, EC 3.1.1.20) sobre la cual, Lehka y Lonsane (1994) reportaron que no era excretada al rnedlo de cultlvo por Aspergillus nlger PKL104 cultlvado en rnedio Ilquldo, como lo era en el medio sólido, reportando que se trataba de un sistema enzimático con fisiología muy distinta en ambos tipos de medio de cultivo. Para responder estas cuestiones se decidió utilizar un soporte sólido modelo, la espuma de poliuretano, porque es un material poroso, inerte y con gran capacidad de absorber grandes cantidades 'de medio líquido y porque ha sido demostrado que funciona como un buen soporte para la producción de enzimas microbianas (Pandey y col., 1999). Entre las preguntas específicas que se desea contestar sobresalen: a) ¿El patrón fisiológico de producción de la tanasa en medio sólido y líquido es el mismo, con respecto a su asociación con el crecimiento y a la presencia o ausencia de un proceso destructivo en el medio?, b) ¿la productividad de la tanasa es mayor en medio sólido que en líquido, debido principalmente porque se produce más biomasa (coeficientes p y X,,,,,) o porque la biomasa produce más enzima (YEIx)?. c) Lesa productividad es aumentada o disminuida por la adición de glucosa, en presencia de un material inductor (el ácido tánico)? y d) Si hubiese diferencias en la tasa secundaria de destrucción de la enzima (k) ¿éstas se asocian o no a la presencia concomitantes de proteasas en el medio de cultivo?. Para responder a esas preguntas se procedió a desarrollar un conjunto de experimentos utilizando ácido tánico como fuente de la molécula inductora y la glucosa como represor de la actividad tanasa. Adicionalmente, se evaluó el efecto del ácido gálico (producto de la reacción de hidrólisis del ácido tánico) en la síntesis de la tanasa en cultivo líquido. Para demostrar la capacidad del cultivo sólido para minimizar la represión catabólica en la síntesis de la tanasa se . estableció como criterio de evaluación, la comparación de los patrones de produccion tanto en condiciones de inducción como de represión de la síntesis de la enzima en ambos sistemas de cultivo. Los resultados obtenidos en la producción de la tanasa demostraron que: a) Los títulos de actividad alcanzados son mayores (hasta 6 veces) en cultivo sólido que en cultivo líquido. En cultivo sólido la productividad máxima fue siempre mayor que en cultivo líquido, siendo entre 2 y 7 veces mayor en los experimentos con ácido tánico y hasta 4 veces en aquellos con ácido tánico y glucosa. b) En los cultivos con ácido tánico y glucosa-ácido tánico, el análisis combinado de los parámetros cinéticos (p YEIX X,,,) indicó que el valor de la productividad a diferencia de lo reportado para otras enzirnas, está fuertemente influenciado por YE/X y no por Xmax ni p, aunque las diferencias en estos parámetros también fueron importantes, los cuales fueron superiores en cultivo liquido con ácido tánico (Xmax) y con glucosa-ácido tánico (p), en comparacibn con aquellos obtenidos para el cultivo sólido. c) Los patrones de producción en condiciones de inducción y represión de la tanasa fueron diferentes en ambos sistemas de cultivo. Altas concentraciones cle ácido tánico (superiores a 25 gL-1) afectaron seriamente la relación de inducción de la tanasa en cultivo líquido, mientras que en el cultivo sólido favorecieron la expresión de la actividad enzilmática. La relación de inducción máxima en cultivo líquido fue de 4 mientras que en el cultivo sólido fue de hasta 17. La adición de glucosa a concentraciones bajas (menores a 50 gL-1) provocó condiciones de represión catabólica en la expresión de la tanasa en cultivo liquido. Una concentracictn de 25 gL-I de glucosa redujo el valor de la relación de inducción por debajo de 1 mientras que a 50 gL-I, la relación fue igual a cero. El uso de altas concentraciones de glucosa en cultivo sólido afectó seriamente la relación de inducción enzimática, aunque no se presentó el mismo fenómeno que en cultivo liquido. Los valores de la relación de inducción disminuyeron hasta 1.3 y 2 lpara la actividad intra y extracelular, respectivamente. En cultivo liquido, se observó que la actividad tanasa era inestable, lo cual se asoció a la presencia de actividades proteolíticas (al menos 6 veces mayores en cultivo líquido que en cultivo sólido). . d) Tanto la actividad tanasa intracelular como extracelular en ambos sistemas de cultivo siguieron el modelo de Luedeking y Piret, obteniendo valores negativos para la constante k (grado de asociación del producto al crecimiento microbiano) en cultivo liquido y positivos para el cultivo sólido con ácido tánico como única fuente de carbono. Los valores negativos de k fueron asociados a las tasas de destrucción de la tanasa en el medio de cultivo por proteasas, mientras que el incremento de la actividad tanasa en función de la cultivo sólido favorecieron la expresión de la actividad enzilmática. La relación de inducción máxima en cultivo líquido fue de 4 mientras que en el cultivo sólido fue de hasta 17. La adición de glucosa a concentraciones bajas (menores a 50 gL-1) provocó condiciones de represión catabólica en la expresión de la tanasa en cultivo liquido. Una concentracictn de 25 gL-I de glucosa redujo el valor de la relación de inducción por debajo de 1 mientras que a 50 gL-I, la relación fue igual a cero. El uso de altas concentraciones de glucosa en cultivo sólido afectó seriamente la relación de inducción enzimática, aunque no se presentó el mismo fenómeno que en cultivo liquido. Los valores de la relación de inducción disminuyeron hasta 1.3 y 2 lpara la actividad intra y extracelular, respectivamente. En cultivo liquido, se observó que la actividad tanasa era inestable, lo cual se asoció a la presencia de actividades proteolíticas (al menos 6 veces mayores en cultivo líquido que en cultivo sólido). . d) Tanto la actividad tanasa intracelular como extracelular en ambos sistemas de cultivo siguieron el modelo de Luedeking y Piret, obteniendo valores negativos para la constante k (grado de asociación del producto al crecimiento microbiano) en cultivo liquido y positivos para el cultivo sólido con ácido tánico como única fuente de carbono. Los valores negativos de k fueron asociados a las tasas de destrucción de la tanasa en el medio de cultivo por proteasas, mientras que el incremento de la actividad tanasa en función de la concentración del sustrato, coincidió con los valores positivos de k en cultivo sólido