Evaluación de la respuesta inmune mediada por células en niños desnutridos - Nájera Medina, Oralia (Universidad Autónoma Metropolitana, 2001)
La desnutrición calórico-proteínica es un problema de salud pública que aunada a los procesos infecciosos se coloca en las primeras causas de morbilidad y mortalidad infantil. La susceptibilidad de los individuos desnutridos a padecer infecciones, se ha asociado al efecto de la desnutrición sobre los mecanismos de defensa inmunológica, por lo que se les ha considerado como pacientes inmunodeficientes, en especial a niños y personas de edad avanzada. Actualmente existen numerosos reportes de investigación sobre el daño encontrado en el sistema inmune de niños con desnutrición severa, tanto en órganos primarios, como en órganos secundarios. Con relación a la inmunidad natural y la inmunidad adquirida, también se han realizado diversos estudios sobre el daño que se observa, aunque en algunos de ellos existen controversias. Con relación a la inmunidad mediada por células, que es el objeto de estudio de este trabajo, se ha encontrado una gran variedad de resultados. Algunos autores reportan número normal de Iinfocitos T en sangre periférica, otros una disminución cuantitativa de ellos; para otros autores son los linfocitos T CD4' los que se encuentran disminuidos y los T CD8' aumentados. En el caso de activaciónlfuncionalidad, algunos autores consideran que la respuesta de los Iinfocitos a la acción de los mitógenos se encuentra disminuida, en cambio otros consideran que es normal y un tercer grupo considera que su respuesta se encuentra aumentada. A partir de la diversidad de resultados, tanto en sub-poblaciones de linfocitos como en su funcionalidad, se consideró importante continuar con las investigaciones que permitieran contribuir al conocimiento del efecto de la desnutrición sobre las diferentes sub-poblaciones y funcionalidad de los Iinfocitos en sangre periférica. El objetivo general del presente trabajo fue evaluar la respuesta inmune mediada por células en niños bien nutridos con infección y niños con desnutrición moderada y severa, ambos con infección. La evaluación consistió en medir en sangre periférica el porcentaje de las sub-poblaciones de linfocitos: T (CD3') y dentro de ellos los T CD4' y T CD8', B (CD20') y NK (CD56'). Además, se determinaron las células CD45RA'/CD45RO- (nativas), CD45RA'/CD45RO' (dobles positivas) y CD45RACD45RO' (de memoria) en el total de los linfocitos y dentro de los linfocitos T CD4'. También se evaluó la funcionalidad de los linfocitos a través del empleo de mitógenos (PHA, PWM e IL-2) in vitro y por medio de la expresión del antígeno de activación temprana CD69. Para lograr estos objetivos se utilizaron dos ensayos metodológicos, ambos empleando la citometría de flujo: 1. A través de la técnica de citometría de flujo se identificaron, las diferentes poblaciones de células en sangre de los niños empleando una mezcla de dos o tres anticuerpos monoclonales de diferente especificidad, conjugados con diversos fluorocromos. Con esta metodología de lisis con lavado se identificaron y enumeraron simultáneamente los diferentes tipos celulares de sangre periférica. Se determinó primeramente l porcentaje de linfocitos, granulocitos y monocitos. Posteriormente en la región de linfocitos se determinaron los porcentajes de linfocitos T (CD3', CD4' y CD8'), B (CD20'), NK (CD56+CD16) y T Activos (HLA-DR'). También se identificaron las células nativas (CD45RA') dobles positivas (CD45RA'/CD45RO') y de memoria (CD45RO') en el total de los Iinfocitos y dentro de los linfocitos T CD4'. Se midió la funcionalidad de los diferentes Iinfocitos T (CD3', CD4' y CD8'), B (CD19') y NK (CD56'), en ensayos de sangre completa, se indujo la activación de linfocitos in vitro con mitógenos: la fitohemaglutinina (PHA) y el CD2-CD2R (control positivo) para linfocitos T (CD3', CD4' y CD8'); el mitógeno de fitolaca, pokeweed (PWM) para linfocitos B (CD19') y la interleucina 2 (IL-2) para linfocitos NK (CD56'). Para determinar la intensidad de la activación se emplearon una mezcla de anticuerpos de tres colores de diferente especificidad conjugados con diversos fluorocromos. Con éSta metodología de lisis sinlavado se evaluó a activación/funcionalidad, detectando la expresión del antígeno de activación temprana CD69. Estas dos modalidades metodológicas fueron aplicadas en tres grupos de estudio: en niños bien nutridos sanos, en niños bien nutridos con infección y en niños desnutridos infectados. Para lograr los objetivos planteados se determinaron en un primer momento los valores en el grupo testigo, formado por los niños bien nutridos sanos, tanto en las sub-poblaciones de linfocitos como en la activación de linfocitos. Estos datos sirvieron de base para detectar los cambios que pudieran presentar los niños bien nutridos infectados que reflejan las alteraciones relacionadas con la infección. Posteriormente al establecer las comparaciones entre los niños bien nutridos infectados y los desnutridos con infección se lograron detectar las alteraciones provocadas por la desnutrición. Los datos se presentan en medidas de tendencia central, promedio f. el error estándar. Se realizó un análisis multivariado, utilizando el programa de JMP, y las diferencias estadísticas se definieron con la prueba no paramétrica de Wilcoxon y Kruskal-Wallis. La significancia fue establecida con una p<0.05. Las aportaciones principales del presente trabajo son: A. Se definieron los valores del grupo control en niños bien nutridos preescolares sanos, para las sub-poblaciones de linfocitos y su respuesta in vifro incubados con mitógenos, para el Laboratorio de Biología Celular y Citometría de Flujo de la UAM-I; estableciéndose que en estos niños los ajustes y desplazamientos de las células linfoides se realiza entre los primeros dos años de la vida, dado que después de esta edad sus porcentajes de linfocitos a nivel de sangre periférica se asemejan a la de los adultos jóvenes. En las células nativas, de memoria y dobles positivas se encontró que tanto en el total de los linfocitos como dentro de las células CD4', las células nativas disminuyeron y las células de memoria aumentaron con la edad. El aumento de la fracción de células de memoria con la edad se puede relacionar con la exposición a antígenos en los primeros años de la vida y al proceso de maduración del sistema inmune. B. Sobre la activación de los linfocitos en los niños bien nutridos sanos se observó que además del ajuste y movilización de los Iinfocitos en los primeros años de la vida, también presentan diferencias con la edad para responder ante un mitógeno in vitro, mostrando los niños menores de tres años porcentajes menores de activación, a los que mostraron los niños mayores de tres años. Esto podría relacionarse con la inmadurez del sistema inmune que puede coincidir con la susceptibilidad de los niños menores de tres años a contraer un mayor número de enfermedades. C. La comparación de los datos observados en las sub-poblaciones de Iinfocitos T con relación a los niños bien nutridos infectados y los niños desnutridos indican que los cambios encontrados están vinculados a las infecciones que padecen estos niños. Los niños desnutridos mostraron tendencias similares en las sub-poblaciones de linfocitos T a las de los niños bien nutridos infectados. Lo anterior indica que no hay alteraciones asociadas con la desnutrición en las sub-poblaciones de linfocitos T. En cambio se observó que en los linfocitos B, los niños bien nutridos con infección tienden a aumentar significativamente esta subpoblación, en comparación con el grupo testigo, situación que no se vio reflejada en los niños desnutridos. El porcentaje de Iinfocitos B (CD20' y CDI 9') se encontró significativamente disminuido en los niños desnutridos con relación a los niños bien nutridos con infección, situación que señala que esta alteración esta asociada con la desnutrición. En los linfocitos NK no se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de estudio. En las células nativas, de memoria y dobles positivas en el total de los linfocitos no se encontró diferencia significativa en los grupos de estudio. En la expresión de la isoformas CD45RA y CD45RO en los linfocitos CD4' los niños bien nutridos infectados exhibieron un porcentaje aumentado de células de memoria como respuesta a la infección. Los niños desnutridos mostraron un mayor porcentaje de la fracción de células dobles positivas y un porcentaje menor de las células de memoria a las que presentaron los niños bien nutridos infectados. Por lo anterior se podría considerar que los niños desnutridos mantienen una acumulación de células dobles positivas, por la incapacidad de concretar el cambio en la transición de dobles positivas a células de memoria de las isoformas CD45. D. En la activación de las sub-poblaciones de linfocitos T con mitógenos se observó que los niños bien nutridos infectados ante la presencia de un estímulo tienen la capacidad de responder y activar un mayor número de células en comparación con el grupo testigo (sin infección). En la activación de las sub-poblaciones de linfocitos T con mitógenos se observó que los niños bien nutridos infectados ante la presencia de un estímulo tienen la capacidad de responder y activar un mayor número de células en comparación con el grupo testigo (sin infección). En las muestras de los niños desnutridos se manifestó una alteración en la activación de los linfocitos T CD3'CD69', CD4'CD69' y CD8'CD69' para reaccionar ante la presencia de mitógenos in vitro, y con relación a lo mostrado por los niños bien nutridos infectados. La activación de los linfocitos B (CD19'CD69') y NK (CD56'CD69') fue similar en los tres grupos de estudio. Los resultados indican que la desnutrición afecta principalmente la funcionalidad de las sub-poblaciones de linfocitos T y no la presencia de estas sub-poblaciones en sangre periférica. Esta afirmación se sustenta en lo que se observó en la activación y en las sub-poblaciones de linfocitos CD4' dobles positivos y de memoria. Los bajos porcentajes mostrados en las células CD3'CD69', CD4'CD69' y CD8'CD69' (de activación temprana) y la mayor proporción de células CD4'CD45RA'/CD45RO' (dobles positivas) y menor proporción de células CD4'CD45RO' (memoria, activación tardía) sugieren que los niños desnutridos muestran trastornos en el proceso de activación y de diferenciación de los Iinfocitos T para hacer frente a la agresión de antígenos extraños y desencadenar los mecanismos efectores necesarios para eliminar los agentes patógenos. Es probable que esta deficiencia para desencadenar mecanismos efectores eficientes se relacione con el bajo promedio de células 6, traduciéndose en una imposibilidad de movilizar estas células a través del organismo. Estas alteraciones podrían explicar el gran número de infecciones (inmunodeficiencia) de las que son presas estos niños. Se propone que las alteraciones en la funcionalidad de los linfocitos T observadas en los niños con desnutrición, podrían estar relacionadas con diferentes mecanismos: 1 ) Alteraciones en el proceso de activación de los linfocitos T a nivel del receptor TCRCD3 y/o de las moléculas accesorias; 2) Falta de nutrientes que disminuyan la síntesis de proteínas, que permitan crear las moléculas de süperficie que actúan como receptores de las señales bioquímicas para desencadenar la diferenciación de las células; 3) Otra posibilidad es la combinación de ambas. 4) Además también se ha señalado que se podría relacionar con la alteración en la producción de citocinas las cuales median y regulan la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos. Se encontraron anomalías en los niños con desnutrición moderada, tanto en subpoblaciones de linfocitos como en la activación de estos, ya que hasta ahora han sido reportados como pacientes que no se presentan daño en el sistema inmune. Algunos casos incluso presentaron mayor deterioro al mostrado en los niños marasmáticos. Sin embargo es importante aumentar el número de pacientes con desnutrición moderada para poder valorar claramente las diferencias exhibidas por cada tipo y grado de desnutrición. Por último, se considera que las pruebas de activación temprana (CD69) de linfocitos y los isotipos CD45RO (memoria) y CD45RAlCD45RO (dobles positivas) mostraron ser una importante prueba de inmunodepresión.; Protein-energy malnutrition (PEM) associated infections have been considered as the major causes of children morbidity and mortality. Malnourished individuals are more susceptible to infection, and thus, they are considered as immunodeficient. Several reports exist concerning the damage found in primary and secondary organs of the immune system in children with severe malnutrition. In relation to the natural and acquired immunities, some controversies have been reported. For example, concerning the cell-mediated immune response, controversial results in peripheral lymphocyte subpopulation have been found as some authors report an adequate number of T lymphocytes; while others found significantly lower numbers in malnourished than in well-nourished children. Furthermore, increased amount of CD8' T lymphocytes over CD4' have been described. Some authors found that lymphocytes of malnourished children show an impaired activation capability, while an increased response to mitogens are reported elsewhere. A third research group found a similar responses in malnourished and well-nourished children. Taking into account the diversity of the reports, and in order to assess the effects of infection and malnutrition it has been considered important to study the proportion of peripheral lymphocyte subsets and their activation capability The aim of this study was to evaluate the cell-mediated immune response in malnourished infected (second and third malnutrition degree), well-nourished infected and non-infected children. The evaluation consisted in determination in peripheral blood of: a) the lymphocyte subsets: T (CD3', CD4' and CD8'), B (CD20') and NK (CD56'CD16'). b) CD45RA and CD45RO antigen isoforms: CD45RA'/CD45RO- (Naive cells), CD45RA'/CD45RO' (Ddull positive cells) and CD45RA-CD45RO' (memory cells). The distribution was analyzed in total lymphocytes, and in T CD4' lymphocytes cell subsets. c) Early activation of lymphocytes T (CD3', CD4' and CD8'), B (CD19') and NK (CD56') with the mitogens PHA, PWM and IL-2 respectively. This response was measured by analyzing the expression of the early activation antigen CD69. Analyses were carried out using flow cytometry assays. Peripheral lymphocyte subsets were determined using techniques for simultaneous, direct, two or threecolour immunofluorescence staining. Commercially conjugated monoclonal antibodies were fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) and peridin-chlorophyll protein (PerCP) dyes. First, the percentages of leukocytes (lymphocytes, monocytes and granulocytes) were determined. Then a gate was set on the FSC-SSC to obtain lymphocytes region. The fraction of lymphocytes T (CD3', CD4' and CD8'), B (CD20'), NK (CD56'CD16') and T (HLA-DR') was detected. In addition, the distribution of nai've (CD45RA') Ddull (CD45RA'/CD45RO') and memory (CD45RO') cells was analyzed for all lymphocytes and within gate of T CD4'cells. Monoclonal reagents included: (1 ) isotype control; (2) CD45 FITC/CD14 PE; (3) CD45RA FITC; (4) CD45RO PE; and (5) CD4 PerCP. Early activation of T (CD3', CD4' y CD8'), B (CD19') and NK lymphocytes (CD56') were evaluated. Three mitogens were used to activate different lymphocyte subsets: phytohemagglutinin (PHA) for T lymphocytes. Pokeweed (PWM) for B lymphocytes and interleukin 2 (IL-2) for NK lymphocytes. CD69 expression was used to obtain subset-specific information about lymphocyte activation. All these analyses were done in three groups of children: 1 ) malnourished infected (with second and third degree of malnutrition), 2) well-nourished infected and 3) noninfected well-nourished children. Well-nourished children had normal weight and height. Infected children showed severe bacterial infection either respiratory or gastrointestinal. First of all, the age relationships were evaluated, the range for each lymphocyte and their activation capability were determined in a control group (well-nourished uninfected children). Analyze of these three groups were performed in order to identify possible infection-related and malnutrition-related alterations. In general, malnourished children had severe infections; therefore the inclusion of a group of well-nourished infected children hospitalized by severe infections, was considered important. This group might indicate infection related changes. The analysis was carried out in whole blood samples collected the day of hospital admission and prior to treatment. Results were expressed as mean k standard error, and compared using the ANOVA and nonparametric Wilcoxon/Kruskal-Wallis tests, with the JMP statistics program. Statistical significance was considered when p<0.05. The most relevant findings of this work were, A. Lymphocyte subsets and their response to mitogens for well-nourished uninfected children were established. The results obtained indicate: (I] That changes in lymphocytes subsets are present during the first two years of age. After this period the percentages of peripheral blood lymphocytes are similar to those observed in young individuals. (ii) A decrease of naive cells and increase in memory cells are age related. This was observed for all lymphocytes and for T CD4'cells. The increase in the fraction of memory cells may be related with the recall antigenic stimulation and the maturation of the immune system in the first years of life. (ii) Activation capability is also age related. Lymphocytes from children of three years or more, showed an increased response to mitogens as compared to those observed in smaller children. This may be related with immaturity of the immune system. B. Infection related changes. (i) Concerning the subpopulation, the B lymphocyte percentages (CDI 9') were increased in well-nourished infected children. T (CD3') lymphocyte content in well-nourished children was significantly lower in infected compared to non infected children. (ii) In CD4'CD45RA' and CD4'CD45RO' isoforms. well-nourished infected children showed increased percentages of memory cells, an expected response to infection.(iii) In well nourished infected children a higher capability to activate lymphocytes CD3'CD69' and CD8'CD69' cells was found. C. Malnutrition related changes. (i) A decreased proportion of lymphocytes B was found. (ii) An increased proportion of CD4' Ddull cells and the decrease of CD4'CD45RO' cells in malnourished children may be due to an alteration when switching from the Ddull to memory cells. The CD45RO' cells may reexpress a Ddull phenotype. (iii) An impaired activation capability in lymphocytes T (CD3'CD69', CD4'CD69' and CD8'CD69') of malnourished than those observed in well-nourished infected children was found. There are several factors that may contribute to immune system alteration processes in malnourished children: the activation incapability of the T cell receptor (TCWCD3) or the accessory molecules; lack of nutrients which would alter the production of new proteins needed to synthesize surface receptors to trigger cell differentiation; a combination of both mechanisms. In conclusion: The immune system impairment in severe malnourished children may be related mainly to the altered physiology of lymphocytes T CD3', rather than to a fall in the number of peripheral blood lymphocyte T subpopulations. The data obtained in this work indicate that the analysis of CD45RO' and CD45FW'/CD45RO' expression on CD4+ lymphocytes and early activation (CD69) were a valuable immunosupression test in malnutrition. This sort of analysis in malnourished infected children may help to understand the mechanisms of immunodeficiency in malnutrition. Further studies using in vitro activation and other surface antigens may be necessary to support this finding.