Efectos de la inhibición de la síntesis del óxido nítrico sobre la implantación, la concentración de GMPc y la peroxidación de lípidos y de proteínas - Durán Reyes, Genoveva (Universidad Autónoma Metropolitana, 2000)
Recientemente, el óxido nítrico ('NO) ha adquirido gran interés clínico debido a su efecto como relajante del músculo liso. Dicha información cubre las principales áreas de las complicaciones de la preñez, principalmente nacimientos prematuros, preclampsia, retardo del crecimiento intrauterino y las de la implantación. El 'NO es una molécula sin carga que posee siete electrones del nitrógeno y ocho del oxígeno. Ya que los orbitales contienen un máximo de 2 electrones, el último orbital contiene un electrón desapareado. El 'NO se produce in vivo durante la conversión de. L-arginina a citrulina por una reacción catalizada por la óxido nítrico sintasa (NOS). De esta enzima han sido clasificadas dos isoformas en base a su mecanismo de regulación. La NOS constitutiva (NOSc), presente en las células endoteliales y neuronales y regulada por Ca2' y la inducible (NOSI) detectada principalmente en los macrófagos y los neutrófilos, es Ca2' independiente y es regulada a nivel transcripcional. Las NOS pueden ser inhibidas selectivamente por análogos de la L-arginina. Compuestos como la L-nitro-arginina ((L-NA), L-nitro-monometiL-arginina (L-NMMA) y L-arginina metil-ester (L-NAME) inhiben competitivamente a !a NOS. La acción de estos análogos puede ser competitivamente revertida por la adición de altas concentraciones de L-arginina y donadores del 'NO La bioquímica del óxido nítrico ha sido definida como la química de este radical libre que involucra a sus blancos biológicos y sus efectos han sido clasificados en directos e indirectos. Los efectos directos son el resultado de la reacción entre .el.. 'NCI y biomoléculas específicas. Los indirectos son aquellos que &sultan de las reacciones de especies reactivas del .'NO (RNOS) (derivadas de la autoxidación dol óxido nítrico) con varios blancps biológicos. Las reacciones directas (efectos directos) con centros metálicos son cruciales para el comportamiento del óxido nítrico como molécula de señalización intracelular. Por ejemplo la reacci&-entre el 'NO y los cofactores hemo dentro de las proteinas es importante en la F"-g re ulación de la actividad de la guanilil ciclasa. El 'NO de esta forma estimula la conv';srslón de GTP a GMPc LOS efectos ind6ctos son el resultado de las reacciones entre el 'NO y el oxígeno (02) O el anión superóxido (02") para formar óxidos de nitrógeno (NO,) o peroxinitrito (ONOO-). El peroxinitrito es un potente ,oxidante que reacciona con la mayoría de las biomoléculas. Ya que el ‘NO es una molécula con una vida media muy corta, es probable que su acción se efectúe a través del efecto oxidante de sus metabolítos, como el ONOO-. El ‘NO ha sido implicado en procesos fisiológicos y patológicos; ya que puede actuar como molécula de señalización, agente anti-infeccioso o antioxidante. La primera acción descrita del ‘NO esta relacionada con su efecto sobre la circulación y la presión sanguínea; la reacción del óxido nítrico con la guanilil ciclasa aumenta la concentración de GMPc y provoca vasorelajación. Por este mecanismo, el óxido nítrico inhibe la agregación plaquetaria, participa en la erección peniana y en el sistema nervioso, regula la liberación de neurotransmisores. La implantación del embrión, un evento que en la rata inicia en la noche del 5O día, es precedida por la diferenciación de un endometrio no receptivo a uno receptivo. Esta transformación implica un incremento en la permeabilidad vascular, la formación de edema y la subsecuente formación del tejido decidual en el sitio donde el blastocisto se implantará. Aunque se ha demostrado que el aumento en la permeabilidad vascular que se presenta en el útero durante la implantación puede ser inducida por prostaglandinas o histamina, no se conocen los factores que regulan este fenómeno. Estudios recientes han establecido que el ‘NO regula la producción de GMPc y prostaglandinas por medio de su efecto estimulador sobre la guanilil ciclasa y !a ciclooxigenasa. Nosotros proponemos que el ‘NO es indispensable en el sitio de implantación del embrión, contribuyendo por medio del GMPc con el aumento de la fluidez de la membrana y la permeabilidad vascular necesarias para la formación del edema. Además, por medio de sus efectos indirectos, aportando el nivel de peroxidación de biomoléculas adecuado para la implantación. En nuestro modelo experimental utilizamos 4 grupos de 10 ratas cada uno: A, B, C y D. A las ratas del grupo “A” se les administró en el cuerno uterino derecho 114 nmoles de L-nitro-arginina, a las del grupo “B”, la misma concentración :de Lnitroarginina + 228 nmoles de nitroso glutatión, a las del grupo “C” igual concentración de L-nitroarginina + 342 moles de L-arginina y al grupo “D” 114 nmomoles de D-arginina. Como control, a todas las ratas se les administraron 114 nmoles de D-arginina en el cuerno uterino izquierdo. Cinco ratas de cada grupo fueron sacrificadas al 6” día de preñez con la finalidad de $valuar el número de sitios y no sitios de implantacj6n;’y obtener el tejido para las determinaciones de GMPc, carbonilos y peroxidacian de lípidos. Las otras 5 ratas se dejaron evolucionar hasta el día 19 de la preñez con la finalidad de observar si los embriones pueden llegar vivos hasta esta etapa. Con este trabajo -encontramos que la inhibición de la síntesis del ‘NO en el útero de la rata suprime la implantación, disminuye la concentración de GMPC y disminuye la peroxidación deproteínas y aumenta la lipoperoxidación, por lo que suponemos que durante esta eKpa el óxido nítrico participa por medio de sus efectos.: directos, activando a la guanilil ciclasa, e indirectos, por medio del peroxinitrito, aumentando el nivel de peroxidación de biomeléculas.; The nitric oxide ('NO) recently becomes of clinical interest because of its relaxant effects on smooth muscle. The potential clinical interest of such information covers the main areas of pregnancy complications, namely preterm delivery, preeclampsia, intrauterine growth retardation and implantation. Nitric oxide is an uncharged molecule composed of seven electrons from nitrogen and eight from oxygen. Due to each orbital can contain a maximum of two electrons, the highest occupied orbital in nitric oxide must contain an unpaired electron In vivo nitric oxide is produced in vivo during the conversion of L-arginine to Lcitruline by a reaction catalyzed by nitric oxide synthases enzymes (NOS): Two classes of NOS have been identified based on its mechanism of regulation. The constitutive NOS (cNOS), present in the endothelial and neuronal cells, is regulated by [Caz'], whereas the inducible NOS (¡NOS) is mainly detectable in macrophages, and neutrophils and is regulated at transcriptional level. Nitric oxide synthase can be selectively inhibited by L-arginine analogs. Analogues of L-arginine such as L-nitroarginine (L-NA), L-nitro-monometil-L-arginine and L-nitro-arginine metil ester (LNAME) inhibit the synthesis of 'NO. They act by competing with L-arginine at the NOS active site. The action of these analogues can be competitively reversed by the addition of higher concentrations of L-arginine and 'NO donors. T.he chemical biology of 'NO has been defined as the specific chemistry of 'NO involving biological targets and this has been categorized into direct and indirect effects. Direct effects results from reactions between 'NO and specific biological molecules. Indirect effects are defined as those resulting from the reactions of reactive nitrogen oxide species (RNOS: which are derived from 'NO autoxidation) with various biological targets. Direct reactions (direct effects) with metal centers are crucial to understanding the bioregulatory behavior of 'NO and why this molecule can serve as a signaling agent. For' instance, the reaction between NO and heme cofactors within the protein is important in the regulation of guanylate cyclase activity. Nitric oxide has been shown to bind to the heme moiety of this thereby stimulating the co_nversion of GTP o cGMP. Indirect effects are caused as resulting from reactions between 'NO and oxygen (O2) or superoxide (02") to form nitrogen oxides (NOx) or peroxynitrite (ONOO-). Peroxynitrite reacts relatively slowly with most biological molecules, making peroxynitrite a pófent oxidant. Nonetheless, since 'NO is a.molecule with a very short half-life, it is probable that its mechanism of action also takes place through the oxidative effect .of its metabolites, as peroxinitrite (-ONOO), on certain macromolecules52/- Embryo implantaJon, an event that in the rat starts on the evening of the fifth day of pregnancy, is p'receded by the diferentiation of a non-receptive endometrium into a receptive one. This transformation implies an increase in vascular permeability, the presence of edema and the subsequent of decidual tissue formation at the site where the blastocyst will be implanted. In addition, in this same specie, blastocyst adhesion to the maternal epithelium implies the displacement of this tissue though its planed cellular death or apoptosis. Although it has been demonstrated that the increase in vascular permeability seen in the uterus during implantation can be induced by prostaglandins or histamine, it is unknown what factors regulate this phenomenon. Recent studies have established that 'NO regulates the production of cGMP and prostaglandins by means of this free radical's stimulating effect on the enzymes guanilyl cyclase and cycooxygenase. We propose that the presence of 'NO and cGMP are required at the embryo implantation site during the stage of maximum receptivity in order to increase the membrane fluidity and vascular permeability necessary for the formation of edema. In addition, the synthesis of cGMP is regulated by 'NO. The effect of L-nitro-arginine on embryonic implantation and cGMP, protein peroxidation and lipid peroxidation was assessed in the implantation site. The intraluminal administration of 114 nmoles of L-nitro-arginine inhibited implantation in 34 OYó and embryo survival (loo%), while in addition, decreasing cGMP concentration both at the site as well non implantation site. Carbonyl groups concentration was considerably less at the implantation site treated with L-nitro-arginine than in the control. Level lipid peroxidation was higher at the uterine corn treated with L-nitroarginine than in the control In the present study, we demonstrated that the inhibition of 'NO synthesis .in ..the rat endometrium suppresses implantation, decreases tisular cGMP concentration and alters the levels of protein peroxidation and lipoperoxidation.