Evaluación de la diversidad y dinámica bacteriana del chorizo tipo español durante su proceso de maduración, mediante DGGE y secuenciación masiva - Juárez Castelán, Carmen Josefina (Universidad Autónoma Metropolitana, 2019)
Spanish-type chorizo is ripening meat product that is highly appreciated by consumers for its excellent sensory characteristics. This meat product was analyzed at different ripening stages (0, 10, 20 and 3 days). The proximal analysis was carried out, in addition to the physicochemical properties pH, water activity (aw), total acidity (AT) and malonaldehyde content (MDA). The population of total aerobic mesophilic, lactic acid bacteria (LAB) and enterobacteria were determined by traditional microbiological methods. The colonies isolated during the ripening process were identified by the 16S rRNA gene sequencing; also, their antagonistic (against Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus curvatus and Pediococcus acidilactici, lipolytic and proteolytic activity were evaluated; as well as their resistance to pH, NaCl, temperature and bile salts, in order to know the biotechnological potential of the identified strains. On the other hand, the diversity and bacterial dynamics associated with the maturation process were analyzed by means of the molecular electrophoresis technique with denaturing gradient gel (DGGE) and by massive sequencing of each of the samples, which was carried out with technology of MiSeq Illumina high-throughput sequencing technology. The proximal chemical analysis showed an increase in the content of ashes, fat and protein, and a decrease in humidity by approximately 50%. The values obtained from the physicochemical parameters analyzed were as expected, in accordance with the commercial stability and microbiological safety of the product. The pH and the aw decreased during the ripening process, while the content of AT and MDA increased significantly in accordance to the quality and characteristics of the meat product. These data are correlated with changes in the bacterial population, a decrease in the CFU of the enterobacteria and an increase in the LAB were observed. Some of the bacteria that were identified by sequencing the 16S rRNA gene were: Lactobacillus sakei, Weissella thailandensis and Pediococcus acidilactici, the latter being the only strain that presented positive antagonistic activity against a greater number of the altered microorganisms tested (Lactobacillus curvatus, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes), and the highest lipolytic and proteolytic activity, which is why it was considered the strain with the greatest biotechnological potential. The diversity obtained by the DGGE technique shows the genera Pseudomonas and Lactobacillus as the most abundant at the beginning and end of the ripening process, respectively, and the strains Pseudomonas fragi, Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus were identified as the most predominant with this analysis. These two genera are also reported in the metagenomic analysis. However, with the massive sequencing it was possible to visualize in greater detail the changes within the bacterial diversity of each of the analyzed times. Between 679,000 and 868,000 paired sequences were obtained from each ripening stage. The total bacterial diversity in the initial sample was represented by phyla Proteobacteria (44%) and Firmicutes (55%), where Pseudomonas (23%), Streptococcus (21%), Acinetobacter (14%), Bacillus (13%) and Brochothrix (11%) were the most abundant genera, in contrast, Firmicutes phyla increased up to 89%, Lactobacillus and Streptococcus being the most representative genera during the ripening process, and within the possible dominant and subdominant species, Lactobacillus sakei, Streptococcus salivarius, Acinetobacter sp., Bacillus subtilis, Pseudomonas fragi and Lactobacillus curvatus, among others, were identified.; El chorizo tipo español es un producto cárnico madurado altamente apreciado por los consumidores debido a sus excelentes características sensoriales. Este producto cárnico fue analizado en diferentes etapas de maduración (0, 10, 20 y 30 días). Se realizó el análisis químico proximal y se evaluaron los parámetros fisicoquímicos de pH y actividad de agua (aw), así como la acidez total (AT) y contenido de malonaldehído (MDA). Se determinó la población de mesófilos aerobios totales, bacterias ácido lácticas (BAL) y enterobacterias por métodos tradicionales de microbiología. Las colonias aisladas durante el proceso de maduración fueron identificadas mediante la secuenciación del gen 16S rRNA y evaluadas en su actividad antagónica ante microorganismos alterantes (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus curvatus y Pediococcus acidilactici), lipolítica y proteolítica, además de su resistencia a pH, NaCl, temperatura y sales biliares, con el fin de conocer el potencial biotecnológico de cada una de las cepas identificadas. Por otra parte, se analizó la diversidad y dinámica bacteriana asociada al proceso de maduración mediante la técnica molecular de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) y mediante la secuenciación masiva de cada una de las muestras, la cual se llevó a cabo con tecnología de secuenciación de alto rendimiento MiSeq Illumina. El análisis químico proximal mostró un aumento en el contenido de cenizas, grasa y proteína, y una disminución de humedad en aproximadamente un 50%. Los valores obtenidos de los parámetros fisicoquímicos analizados fueron los esperados, acorde con la estabilidad comercial y seguridad microbiológica del producto. El pH y la aw disminuyeron durante el proceso de maduración y el contenido de AT y MDA se incrementaron significativamente dentro de los parámetros de calidad y características del producto cárnico, estos cambios están correlacionados con la dinámica en la población bacteriana. Se observó una disminución en las UFC de las enterobacterias y un aumento de las BAL. Algunas de las bacterias identificadas mediante la secuenciación del gen completo 16S rRNA fueron: Lactobacillus sakei, Weissella thailandensis y Pediococcus acidilactici, está última como la única cepa que presentó mayor actividad antagónica contra los microorganismos alterantes probados (Lactobacillus curvatus, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes), y la mayor actividad lipolítica y proteolítica, por lo que se consideró como la cepa con mayor potencial biotecnológico. La diversidad obtenida mediante la técnica de PCRDGGE, muestra a Pseudomonas y Lactobacillus como los géneros más abundantes al inicio y término del proceso de maduración (respectivamente), y se identificó a las cepas Pseudomonas fragi, Lactobacillus sakei y Lactobacillus curvatus como los más predominantes con esté análisis. Los dos géneros anteriormente mencionados también fueron identificados en el análisis de secuenciación masiva. Sin embargo, con esta tecnología se logró visualizar con mayor profundidad los cambios en la diversidad bacteriana de cada una de las muestras analizadas. Se obtuvieron entre 679,000 y 868,000 secuencias pareadas de cada tiempo de maduración. La diversidad total bacteriana en la muestra inicial fue representada por los phyla Proteobacteria (44%) y Firmicutes (55%), donde los géneros Pseudomonas (23%), Streptococcus (21%), Acinetobacter (14%), Bacillus (13%) y Brochothrix (11%) fueron los abundantes. En contraste, el phylum Firmicutes aumentó hasta en un 89%, siendo Lactobacillus y Streptococcus los géneros más representativos durante el proceso de maduración y dentro de las posibles especies dominante y subdominantes se identificó a Lactobacillus sakei, Streptococcus salivarius, Acinetobacter sp., Bacillus subtilis, Pseudomonas fragi y Lactobacillus curvatus, entre otros.