Caracterización del efecto de ISM1 sobre células Leucémicas Humanas - Aguirre Guillen, William Alejandro (Universidad Autónoma Metropolitana, 2018)
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el tipo de leucemia más frecuente en individuos pediátricos, siendo la LLA-B la más común (80%-85%) en comparación a la LLA-T (10-15%). La tasa de sobrevivencia a 5 años de LLA infantil en países desarrollados es del 90%, mientras que, en México, es de aproximadamente 67%. El desarrollo de nuevos tratamientos contra nuevos blancos terapéuticos es necesario para reducir los efectos secundarios y mejorar la calidad de vida. En este sentido, la proteína de choque térmico GRP78, regulador de la vía UPR, ha demostrado relocalizarse hacia la membrana plasmática preferentemente en células cancerosas, donde actúa como receptor para un número creciente de ligandos promoviendo proliferación o muerte celular dependiendo del ligando. Bajo este contexto, se ha reportado que ISM1, una proteína de secreción de 60 kDa, interacciona con GRP78 en la superficie celular provocando una disfunción mitocondrial que lleva a la muerte celular por apoptosis en células cancerosas. Material y Métodos Con el fin de elucidar si ISM1 promueve un efecto proapoptótico en células de LLA que relocalizan GRP78 hacia la membrana plasmática, primero se determinó, a través de citometría de flujo, la presencia de la proteína en la superficie celular de líneas celulares de LLA- B, LLA- T y muestras de pacientes pediátricos al momento del diagnóstico con LLA. Una vez identificada la población GRP78+ en los modelos de estudio, se estimuló la población total de la línea RS4:11 y células leucémicas de individuos pediátricos con 1µg/mL y 5µg/mL de ISM1 recombinante de ratón respectivamente. Para poder observar el efecto de ISM1 únicamente sobre las células leucémicas GRP78+, se purificaron a través de FACS o columnas inmunomagnéticas. Resultados La línea celular RS4;11 de LLA-B, tuvo la mayor frecuencia de células que relocalizan GRP78 con un 0.56% ± 0.041 de la población en comparación a la línea celular Reh (0.18% ± 0.069) y que sus contrapartes de LLA-T; Jurkat (0.16% ± 0.076) y CCRF (0.16% ± 0.063). Las células de individuos pediátricos al diagnóstico con LLA, presentaron una mayor frecuencia de células GRP78+ en células de médula ósea 3.95% ± 1.38 (n=7) comparadas con las obtenidas de sangre periférica 0.93% ± 0.69 (n=3). Por su parte las células de individuo pediátrico sano tuvieron una frecuencia del 0.57%. El efecto proapoptótico de ISM1, sobre células RS4;11 y células de individuos pediátricos al momento de diagnóstico con LLA, no se logró correlacionar con la frecuencia inicial de células GRP78+ en la población total, sin embargo, en las últimas se observó una reducción en la frecuencia de células GRP78+ bajo el estímulo con ISM1 (11.58%) en comparación al control negativo (15.21%). Finalmente, la purificación de células GRP78+ a través de FACS y columnas inmunomagnéticas en ambos modelos de estudio no fue factible. Conclusiones El estudio determinó que, en frecuencias variables, las células leucémicas humanas relocalizan GRP78 hacia la membrana plasmática, teniendo una mayor frecuencia aquellas de médula ósea. El efecto proapoptótico de ISM1 sobre células leucémicas viii GRP78+ no se logró determinar utilizando la población celular total, sin embargo, la reducción en la frecuencia de células GRP78+ en muestras de individuos pediátricos bajo el tratamiento con ISM1 sugiere la interacción ISM1-GRP78.; Background Acute lymphoblastic leukemia is the most common cancer among children. ALL-B accounts for about 80-85% whereas ALL-T represents about 10-15% of cancer diagnoses. The 5-year survival rate in developed countries is around 90% while in Mexico is about 67%. Development of innovative treatments against novel therapeutic targets is necessary to reduce side effects and improve quality of life. In this context, GRP78, an important molecular chaperone in UPR signaling, can relocalize preferably to the cell surface of cancer cells where it complexes with specific proteins triggering proliferation or cell death. In this sense, it was reported that ISM1, a secreted 60-kDa protein, upon binding GRP78 on the cell surface of cancer cells triggers apoptosis by inducing mitochondrial dysfunction. Materials and methods In order to elucidate if ISM1 induces apoptosis on leukemic cells that express GRP78 on the cell surface, the presence of this protein on human leukemia cell lines in both ALL- B and in ALL-T was determined by flow cytometry. In addition, GRP78 was determined on leukemia cells from bone marrow and peripheral blood obtained of ALL patients at the time of initial diagnosis. Once identified, GRP78+ total cell populations in both cell lines and ALL patients were treated with 1µg/mL y 5µg/mL of rISM1, respectively. Finally, with the purpose of providing a clear effect, GRP78+ leukemic cells were isolated by FACS or MACS. Results The B-lineage ALL cell line RS4:11 showed the higher cell frequency, between cell lines, that relocalize GRP78 to the cell surface (0.56% ± 0.041) in comparison with cell line Reh 0.18% ± 0.069), Jurkat (0.16% ± 0.076) and CCRF (0.16% ± 0.063). On the other hand, primary leukemic cells from bone marrow of ALL patients at the time of initial diagnosis had a GRP78+ cell frequency about 3.95% ± 1.38 (n=7) which is higher than peripheral blood 0.93% ± 0.69 (n=3). Additionally, bone marrow cells from a healthy donor had a GRP78+ cell frequency about 0.57%. The proapoptotic effect of ISM1 on GRP78+ leukemic cells from the RS4;11 cell line and childhood ALL patients could not be correlated with initial frequency of cells expressing GRP78 on the plasma membrane, however, there was a decrease in GRP78 positive cells around 11.58% under treatment with ISM1around when compared with control (15.21%). Finally, purification of GRP78+ leukemic cells by FACS or MACS involving both models was not feasible. Conclusions The present study determined that acute lymphoblastic leukemia cells can relocalize GRP78 to the cell surface at different frequencies, being the highest expression in bone marrow leukemic cells. The proapoptotic effect of ISM1 on GRP78+ cells could not be determined, however, a decrease in GRP78 positive cells after treatment suggests an ISM1-GRP78 interaction.