Desarrollo y estandarización de un ensayo para la determinación cuantitativa de la carga proviral y las formas episomales del VIH-1 y su relación con el tropismo proviral - Vergara Mendoza, Moisés (Universidad Autónoma Metropolitana, 2015)
Introducción: El Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) es capaz de establecer un reservorio viral de forma estable en el genoma celular y formas episomales de su genoma en diferentes poblaciones celulares, en particular aquellas que expresan el receptor CD4+ y los correceptores virales CXCR4 y CCR5, los cuales determinan su tropismo. Estas poblaciones son infectadas durante distintas etapas de la enfermedad situándose como blancos de estudio ya que presentan diferentes características que determinan el proceso de patogénesis, el desarrollo de la enfermedad y la generación de reservorios de larga duración. Objetivo: En este trabajo se desarrolló y se estandarizó un método para cuantificar al genoma proviral y la forma episomal 2-LTR del VIH-1 en muestras de pacientes con tratamiento antirretroviral y se evaluó la diferencia entre el reservorio establecido por el virus de acuerdo con su tropismo proviral. Metodología: Para la cuantificación de la carga proviral se emplearon oligonucleótidos dirigidos a las secuencias Alu, usadas como un ancla molecular y un oligonucleótido dirigido a una zona conservada en el gen gag para diferenciar la forma proviral de las episomales. Las células 8E5 que contienen una sola copia del genoma viral, se utilizaron como un estándar para la carga proviral (CP). Para la forma circular 2-LTR se usó un plásmido con la secuencia de unión que abarca 513 pb. Para diferenciar entre las formas circulares, se construyeron de forma sintética dos plásmidos con las secuencias correspondientes a 1-LTR y 2-LTR. Una vez establecidas las curvas patrón, se analizaron 123 muestras de pacientes infectados con el VIH-1 y viremia controlada por la aplicación de un esquema farmacológico supresor. Las muestras analizadas se clasificaron en dos grupos de acuerdo con su tropismo y se determinó la carga proviral y episomal para su comparación. Resultados: Se construyeron curvas patrón para la determinación de la carga proviral y episomal 2-LTR, sin embargo no fue posible diferenciar la forma circular 1- LTR posiblemente por su alto grado de homología con las otras formas del genoma viral. Las curvas patrón se utilizaron para la cuantificación de la CP y 2-LTR en dos grupos de estudio de aislados virales con tropismo para linfocitos T (X4) y para monocitos y macrófagos (R5). Se encontró una mayor CP y episomal 2-LTR en las variantes virales con tropismo R5 en comparación con las variantes X4 y la diferencia fue estadísticamente significativa con una p=0.027 y 0.00008 respectivamente Conclusiones: Se desarrolló un método para la determinación cuantitativa de la carga proviral y episomal 2-LTR del VIH-1, que es reproducible y con un rango de sensibilidad amplio de detección de 1x104 a 1x100 y 1x106 a1x101 respectivamente, por lo que se puede proponer su uso como una herramienta para el seguimiento clínico de los pacientes infectados con el virus y para el estudio del reservorio. Así mismo se evaluó la diferencia entre carga proviral y episomal en muestras con tropismo proviral (X4 y R5) donde se mostró que el tropismo R5 tuvo una mayor carga proviral y 2-LTR respecto a X4.